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« Méthode immuno-enzymatique ELISA » : différence entre les versions

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=== ELISA en sandwich ===
=== ELISA en sandwich ===
[[Fichier:ELISA types.png|centré|vignette|600x600px|(1) La plaque est recouverte avec un anticorps "de capture" ; (2) l'échantillon est ajouté, et tout antigène présent se lie à l'anticorps "de capture" ; (3) l'anticorps de détection est ajouté, et se lie à l'antigène ; (4) l'anticorps secondaire lié à une enzyme est ajouté et lie l'anticorps de détection ; (5) le substrat de l'enzyme est ajouté et converti en une forme détectable (colorée ou fluorescente)]]
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ELISA principle.tif|'''Un ''ELISA'' en sandwich'''. (1) La plaque est recouverte avec un anticorps de capture ; (2) l'échantillon est ajouté, et tout antigène présent se lie à l'anticorps de capture ; (3) l'anticorps de détection est ajouté, et se lie à l'antigène ; (4) L'anticorps secondaire lié à l'enzyme est ajouté, et se lie à l'anticorps de détection ; (5) Le substrat est ajouté et est converti par l'enzyme en une forme détectable (colorée ou fluorescente).
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L'ELISA en sandwich est une variante moins commune (en clinique) de cette technique, utilisée afin de détecter un échantillon d'antigène dans le sérum ou tout autre échantillon. Cette technique est par contre d'un usage très courant en recherche.
L'ELISA en sandwich est une variante moins commune (en clinique) de cette technique, utilisée afin de détecter un échantillon d'antigène dans le sérum ou tout autre échantillon. Cette technique est par contre d'un usage très courant en recherche.



Version du 30 mars 2020 à 20:48

Une plaque de microtitrage à 96 puits, couramment utilisée pour les tests ELISA
Microbiologiste utilisant un test ELISA pour le dépistage du VIH

La méthode immuno-enzymatique ELISA (de l'anglais enzyme-linked immunosorbent assay, littéralement « dosage d'immunoabsorption par enzyme liée », c'est-à-dire dosage immuno-enzymatique sur support solide) est un examen de laboratoire. Cette méthode est principalement utilisée en immunologie pour détecter la présence d'un anticorps ou d'un antigène dans un échantillon.

Ce test immunologique entre dans le cadre plus général des dosages immuno-enzymatiques (ou EIA pour enzyme immunoassays), dans lequel le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme qui libère un composant coloré suivi par une spectroscopie, par opposition aux dosages radio-immunologiques (ou RIA pour radio immunoassays) dans lesquels l'anticorps est marqué par un radioélément et dont le dosage mesure un nombre de désintégrations par seconde.

L'ELISA est une technique biochimique utilisant un ou deux anticorps. L'un de ceux-ci est spécifique de l'antigène, tandis que l'autre réagit aux complexes immuns (antigène-anticorps) et est couplé à une enzyme. Cet anticorps secondaire, responsable du nom de la technique, peut aussi causer l'émission d'un signal par un substrat chromogène ou fluorogène.
L'ELISA pouvant être utilisé tant pour évaluer la présence d'un antigène que celle d'un anticorps dans un échantillon, c'est un outil efficace à la fois pour déterminer des concentrations sériques d'anticorps (comme pour le test HIV ou le virus du Nil), que pour détecter la présence d'un antigène. Il a également trouvé des applications dans l'industrie alimentaire, pour détecter des allergènes alimentaires, comme le lait, les cacahuètes, les noix et les œufs. C'est un test simple, facile d'emploi et peu coûteux. Il est limité par la disponibilité en anticorps spécifique.

Méthodes

ELISA indirect

Les étapes de l'ELISA dite indirecte, la plus couramment utilisée, pour déterminer la concentration en anticorps du sérum sont :

  1. L'application d'un échantillon d'un antigène connu sur une surface, le plus souvent celle d'un puits d'une plaque de microtitration. L'antigène est fixé à la surface, de façon à le rendre immobile.
  2. Le lavage de la plaque au détergent.
  3. La saturation de la plaque en protéines, le plus souvent par rinçage avec une solution de lait en poudre dégraissé suivi d'un lavage au détergent.
  4. Le recouvrement des puits (ou toute autre surface) par les échantillons de sérum à tester (ou tout autre solution à tester), dont la concentration en anticorps est, par définition, inconnue, et habituellement diluée dans le sérum d'une autre espèce. L'utilisation de sérum non humain empêche la liaison à l'antigène par des anticorps non spécifiques contenus dans le sang du patient.
  5. Le rinçage de la plaque, de façon à retirer les anticorps non liés. Après rinçage, seuls les complexes antigène-anticorps demeurent attachés à la surface du puits.
  6. L'ajout aux puits des anticorps secondaires qui se lieront à l'anticorps primaire, (il s'agit dans ce cas d'une antiglobuline). Ces anticorps secondaires sont couplés à l'enzyme modificatrice de substrat qui permet de suivre l'évolution de la réaction.
  7. Le second rinçage de la plaque, de sorte à éliminer les anticorps non liés.
  8. L'application d'un substrat qui, s'il est converti par l'enzyme, émet un signal chromogénique ou fluorescent.
  9. La quantification du résultat, à la vue ou, le plus souvent, par spectrophotométrie ou tout autre appareil d'optique.

L'enzyme agit comme amplificateur : quand bien même peu d'anticorps conjugués à l'enzyme seraient attachés, l'enzyme catalyserait la formation de nombreux signaux, ce qui rend ce test très sensible, mais augmente également le nombre de faux positifs. Il faut donc logiquement prévoir des puits de contrôle.

L'ELISA peut être réalisé à visée quantitative ou qualitative :

  • un résultat qualitatif indiquera la présence ou l'absence d'un antigène dans l'échantillon. Les valeurs-seuil sont déterminées par l'analyste et peuvent être basées sur la statistique. Deux ou trois écarts-types sont généralement utilisés pour distinguer l'échantillon positif du négatif.
  • dans l'utilisation quantitative de l'ELISA, la densité optique ou les unités de fluorescence de l'échantillon sont interpolées sur une courbe d'étalonnage, en général une dilution sérielle de la cible.

Applications

Essais quantitatifs (dosages)

On utilise l'ELISA direct pour le dosage de protéines variées. Quelques exemples tirés d'application en pharmacologie médicale : hormones thyroïdiennes, concentration en médicaments (pour évaluer l'observance et/ou adapter la posologie), etc.

Essais qualitatifs : test VIH par ELISA

L'application la plus connue du grand public est le dépistage en première ligne du VIH.

La technique ELISA permet la détection d'anticorps anti-VIH dans le sérum sanguin (d'où le terme "séropositif" ou "séronégatif). La technique présente une grande sensibilité (la plupart des cas sont détectés, et les « faux négatifs » (=tests négatifs lorsque le patient est séropositif) sont quasi à exclure, du moins si le test est réalisé dans un délai de trois mois après le contact infectant) et une spécificité acceptable (un taux faible de « faux positifs » (= test positif par réaction de l'anticorps avec un antigène non spécifique). Toutefois, en cas de sérologie anti-VIH positive, les échantillons doivent être soumis à des tests de confirmation, comme le western blot, qui utilise une technique basée sur l'électrophorèse et dont le taux d'erreur est extrêmement faible.

ELISA en sandwich

(1) La plaque est recouverte avec un anticorps "de capture" ; (2) l'échantillon est ajouté, et tout antigène présent se lie à l'anticorps "de capture" ; (3) l'anticorps de détection est ajouté, et se lie à l'antigène ; (4) l'anticorps secondaire lié à une enzyme est ajouté et lie l'anticorps de détection ; (5) le substrat de l'enzyme est ajouté et converti en une forme détectable (colorée ou fluorescente)

L'ELISA en sandwich est une variante moins commune (en clinique) de cette technique, utilisée afin de détecter un échantillon d'antigène dans le sérum ou tout autre échantillon. Cette technique est par contre d'un usage très courant en recherche.

Le procédé se déroule, dans ses grandes lignes, comme suit :

  1. Une surface est préparée et une quantité connue d'anticorps dit de capture y est liée.
  2. L'échantillon contenant l'antigène est appliqué à la plaque.
  3. La plaque est rincée, de façon à éliminer l'antigène non lié.
  4. Les anticorps conjugués à l'enzyme sont ajoutés.
  5. La plaque est rincée une deuxième fois.
  6. Le substrat convertible par l'enzyme en signal fluorescent est ajouté.
  7. Le résultat est analysé « à l'œil » ou dans un spectrophotomètre spécialement conçu pour accepter directement les plaques de 96 puits.

Toutefois, ainsi qu'illustré, il existe le plus souvent une étape supplémentaire, l'addition d'anticorps de détection, afin d'éviter de créer des anticorps conjugués à l'enzyme pour chaque antigène. L'utilisation d'une enzyme couplée reconnaissant la fraction Fc des autres anticorps permet de l'utiliser dans une variété de situations et de réduire le coût de la procédure.

ELISA par compétition

Contrairement à l'autre test, l'ELISA par compétition n'utilise pas d'enzyme.

Une troisième utilisation de l'ELISA se fait par compétition de liaison. Elle permet le dosage d'un antigène :

  1. Une plaque est préparée sur laquelle sont fixés des anticorps (en défaut).
  2. Un mélange d'antigènes marqués et des antigènes à doser (non marqués) est déposé sur la plaque.
  3. La plaque est rincée, de sorte que les antigènes non liés aux anticorps sont éliminés.

La compétition joue donc entre les antigènes marqués (en quantité connue) et non marqués (en quantité à déterminer) pour leur liaison aux anticorps, qui sont en défaut. Ainsi plus les antigènes à doser sont nombreux, plus leur proportion parmi les antigènes retenus par les anticorps est grande, et plus le signal sera faible. Inversement, si la concentration initiale de l'antigène est faible, le signal sera fort.

Voir aussi

Bibliographie

  • E. Engvall et P. Perlman, « Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G », Immunochemistry, vol. 8, pages 871-874, 1971. PMID 5135623
  • R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne et J. Kuby, « Enzyme-Linked Immunosorbent Assay », in Immunology, 5e édition, pages 148-150, W. H. Freeman, New York, 2003.

Articles connexes

Liens externes