Proba da oxidase

A proba da oxidase ou test da oxidase é unha proba utilizada en microbioloxía para determinar se unha bacteria produce algunha das citocromo c oxidases. Na proba utilízanse discos impregnados co reactivo N,n,n,n-tetrametil-p-fenilendiamina (ou TMFD) ou N,N-Dimetil-p-fenilendiamina (ou DMFD), o cal é tamén un indicador redox. O reactivo pasa de azul escuro a granate ao ser oxidado, e vólvese transparente ao ser reducido. As bacterias oxidase positivas posúen citocromo oxidase ou indofenol oxidase (unha hemoproteína). Ambas as dúas catalizan o transporte de electróns de compostos doantes (NADH) a aceptores de electróns (polo xeral o oxixeno). Na proba, o reactivo TMFD actúa como doante artificial de electróns para o encima oxidase. O reactivo oxidado forma o composto coloreado de indofenol azul. O sistema citocromo está normalmente presente só nos organismos aerobios que poden utilizar o oxíxeno como aceptor final de electróns e hidróxeno. O produto final deste metabolismo pode ser auga ou peróxido de hidróxeno (molécula tóxica que será rota pola catalase).

O reactivo DMFD.

O reactivo TMFD.

Resultados

As cepas probadas poden ser oxidase positivas (ou oxidase-positivas, OX+) ou oxidase negativas (ou oxidase-negativas, OX-).

Oxidase positiva

Significa que a bacteria posúe citocromo c oxidase, polo que pode usar oxixeno para a produción de enerxía cunha cadea de transporte de electróns. Un exemplo de identificación preliminar é a identificación dos xéneros Neisseria e Moraxella, os cales son ambos os dous diplococos gramnegativos oxidase positivos. Moitos gramnegativos, como os bacilos curvados como Helicobacter pylori, Vibrio cholerae e Campylobacter jejuni son oxidase positivos. Outros xéneros oxidase positivos son Pseudomonas, Aeromonas e Alcaligenes.

Oxidase negativa

As enterobacterias son exemplos típicos de bacterias oxidase negativas. O resultado negativo indica que non teñen citocromo c oxidase, o que significa que non poden usar o oxíxeno na cadea de transporte de electróns ou ben que utilizan un citocromo diferente para a transferencia de electróns ao oxíxeno.

Procedemento

1. Humedécese cada disco (que contén o reactivo) coa asa bacteriolóxica cunhas catro pingas de auga desionizada.
2. Coa asa transfírese unha gran masa de bacterias puras ao disco.
3. Obsérvase o disco durante tres minutos, nese tempo a área de inoculación debe pasar a unha cor entre azul escura e granate ou mesmo negro; se ocorre isto o resultado da proba é positivo. Se non hai cambio nese tempo, a proba é negativa.

Unha maneira alternativa de facer a proba é preparar bacterias cultivadas en placas de ágar tripticase soia utilizando unha técnica estéril facendo unha inoculación nunha soa estría. As placas inoculadas son incubadas a 37 °C durante 24–48 horas para que se formen colonias. Deben utilizarse preparacións bacterianas frescas. Unha vez que as colonias creceron no medio, engádense dúas ou tres pingas do reactivo DMPD sobre a superficie de cada tipo de organismo que vai ser probado. A proba é positiva (OX+) se cambia a cor violeta ou púrpura, en 10–30 segundos. A proba é negativa (OX-) se a cor é rosa clara ou hai ausencia de coloración.

Outros métodos tamén utilizados co reactivo TMPD son:

1. Método en placa directa: Agregar directamente 2-3 pingas de reactivo a algunhas colonias. Non inundar toda a placa e non invertela. Observar os cambios de cor. Co reactivo de Kovacs (TMPD) a reacción prodúcese nuns 10-15 segundos, mentres que co de Gordon e McLeod (DMPD) prodúcese en 10-30 minutos. O TMPD (solución acuosa ao 1% de TMPD ou reactivo de Kovacs) é menos tóxico e máis sensible pero máis caro que o DMPD (reactivo de Gordon e McLeod).
2. Método indirecto sobre papel: Colocar un cacho de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente nunha placa de Petri. Agregar 2-3 pingas do reactivo de Kovacs (TMPD) no centro do papel. Estender coa asa de sementeira unha colonia sobre o papel impregnado. A reacción de cor positiva prodúcese aos 5-10 segundos.