Fluorestsentsmikroskoop

Fluorestsentsmikroskoobi näide. Olympus BX61-l on fluorestsentsi filtreerimiskuubikute torn paigutatud objektiivi kohale. Süsteemis on ka digitaalne kaamera

Fluorestsentsmikroskoop on optiline mikroskoop, mida kasutatakse orgaaniliste ja anorgaaniliste ühendite omaduste uurimiseks, lähtudes pigem fluorestsentsist ja fosforestsentsist kui peegeldumisest ja absorptsioonist, aga samas ei välista nende koos kasutamist. Fluorestsentsmikroskoop on kõnekeeles tuntud ka epifluorestsentsmikroskoobina, kuid see mõiste viitab ka selle mikroskoobi sarnasusele konfokaalmikroskoobiga, mis samuti kasutab oma töös fluorestsentsi.

Algteadmisi fluorestsentsmikroskoopiast

Kõik fluorestsentsmikroskoopia meetodid kasutavad sama põhimõtet. Proovis olevate molekulide ergastamiseks kasutatakse valgusallika sellist lainepikkust või lainepikkuste vahemikku, mille juures proovis olevad molekulid fluorestseeruvad. Proovi fluorestseerumisel kiirguv valgus, mis on enamasti pikemal lainepikkusel kui ergastuslainepikkus (Stokesi fluorestsents), detekteeritakse läbi mikroskoobi objektiivi. Sellise meetodi puhul kasutatakse tavaliselt kahte filtrit: esiteks ergastusfilter, mis tagab ergastuskiirguse kasutamise soovitud lainepikkusel ja selle monokromaatsuse, ning teiseks emissioonfilter, mis tagab selle, et ergastuskiirgus ei jõuaks tajurisse. Fluorestsentsmikroskoopia kasutab kujutise saamiseks põhimõtteliselt teistsugust lähenemist võrreldes neeldunud ja peegeldunud valge valguse tehnikatega, nagu faasikontrastiga ja diferentsiaalinterferentsiga. Need kaks kontrastoptilise mikroskoopia meetodit annavad väga erinevat, kuid teineteist täiendavat infot.

Fluorestsentsmikroskoobi tööpõhimõte

Proovi ergastamiseks kasutatakse konkreetse lainepikkusega (või lainepikkuste vahemikuga) valgust, mis neeldub fluorofoorides, mille tulemusena need osakesed lähevad üldjuhul üle singulaarsesse ergastunud olekusse (näiteks olekusse s1 või s2) ja seejuures enamasti mõnele vibratsiooniergastusnivoole (v1,v2,...,vn). Pärast seda toimub esmalt mittekiirguslik osakeste "lõdvestumine" (võnkerelaksatsioon, sisekonversiooniüleminek), millele järgneb kiirguslik osakeste "relaksatsioon" ehk fluorestsents. Seega emissioonikiirguse energia on mittekiirgusliku relaksatsiooni tõttu madalam kui ergastuskiirguse energia ja emissioonispekter nihkub pikemate lainepikkuste poole (Stokesi nihe). Ka anti-Stokesi nihe on võimalik, kuid rõhuv enamik kvante on siiski Stokesi kvandid, sest toatemperatuuril on enamik osakesi olekus v0. Ergastuskiirgus eraldatakse nõrgemast fluorestsentskiirgusest spektraalse emissioonfiltri abil. Tüüpilised fluorestsentsmikroskoobi osad on järgmised:

• valgusallikas (ksenoonkaarlamp või elavhõbe-gaaslahenduslamp)
• ergastusfilter, poolläbilaskev peegel (või dikromaatne lõhestaja)
• emissioonfilter.

Filtrid ja dikromaatsed peeglid/lõhestajad valitakse selle alusel, et nad oleksid antud analüüdiga seotud fluorofoori ergastus-ja kiirgusspektri parameetrite jaoks sobivad. Sel moel saab korraga avastada ainult ühe fluorofoori (värvi) jaotust. Erinevatest fluorofooridest on võimalik saada mitmevärviline kujutis ühevärviliste kujutiste omavahelisel kombineerimisel.

Enamik kasutusel olevaid fluorestsentsmikroskoope on epifluorestsentsmikroskoobid (s.t proovi ergastamine ja fluorestsentsi vaatlus toimub proovi kohalt). Eriti tähtis koht on neil mikroskoopidel just bioloogia- ja biokeemiaharu teadusuurimustes, samuti on nende mikroskoopide ehitus olnud eeskujuks keerukamate mikroskoopide nagu konfokaalmikroskoop ja totaalne sisepeegeldusfluorestsentsmikroskoop (TIRF) ehitamisel.

Epifluorestsentsmikroskoopia

Fluorestsentsmikroskoobi põhimõtteskeem: (ülevalt alustades) detektor, lääts, emissioonfilter, poolläbilaskev peegel, objektiiv, proov; (detektor-proov sihis risti) ergastusfilter ja valgusallikas

Rääkides fluorestsentsmikroskoopiast, eriti just loodusteaduste vallas, mõeldakse selle all enamasti epifluorestsentsmikroskoopiat. Ergastuskiirgus lastakse proovile peale ülevalt, kui just ei ole tegu tagurpidi mikroskoobiga, mille puhul suunatakse see proovile alt. Ergastuskiirgus läbib objektiivläätse enne, kui see langeb proovile. Analüüdi fluorestseerumisel emiteeruv kiirgus fokuseeritakse detektorisse läbi sama objektiivi, mida kasutatakse ergastuskiirguse koondamiseks. Antud meetod annab parandatud signaali-müra suhte seoses sellega, et detektor ei asu samas sihis valgusallikaga, mistõttu objektiivi jõuab ainult tagasi peegeldunud ergastuskiirgus koos fluorestsentskiirgusega. Proovilt tagasi peegeldunud valgusallikast pärit kiirgusest aitab vabaneda dikromaatse lisafiltri kasutamine objektiivi ja detektori vahel.

Valgusallikad

Fluorestsentsmikroskoopia vajab suure intensiivsusega ja monokromaatsusele lähenevat ergastusvalgust (juhul kui mõõtmistel ei kasutata lainepikkuste vahemikku), mida osad laialt levinud valgusallikad, nagu halogeenlamp, pakkuda ei suuda. Levinud on kahte tüüpi valgusallikad: elavhõbe-gaaslahenduslambid ja ksenoonkaarlampid koos ergastusfiltritega või laserid. Laserite kasutusala piirab lainepikkuste varieerimisvõimaluse puudumine või laseri kallidus, kui see võimalus olemas on. Enamjaolt kasutatakse lasereid just komplitseeritumate fluorestsentsmikroskoopia meetodite puhul, milleks on konfokaalmikroskoopia ja totaalne sisepeegeldusfluorestsentsmikroskoopia. Samas sobivad ksenoonkaarlamp ja elavhõbe-gaaslahenduslamp laia lainepikkuste vahemikuga mõõtmiste jaoks epifluorestsentsmikroskoopias.

Proovi ettevalmistus

Selleks, et proov oleks mõõdetav fluorestsentsmikroskoobiga, peab proovis sisalduv analüüt olema fluorestseeruv. Kui analüüt ei ole fluorestseeruv, siis tema fluorestseeruvaks muutmiseks on mitmeid võimalusi. Peamised neist on järgmised: tehisliku fluorestsentsmärgise kasutamine ja fluorestsetseeruvate proteiinide ekspressioon rakus (levinud bioloogiliste proovide puhul). Alternatiivse meetodina kasutatakse proovi sisemist fluorestseerumist ehk autofluorestsentsi. Sellised proovid sisaldavad autofluorestseeruvaid bioloogilisi molekule (näiteks NADPH ja flaviin), mida kasutatakse sageli selleks, et eraldada kunstlikult lisatud märgiste emissioonkiirgust loomulikult fluorestseeruvate molekulide omast. Fluorestsentsmikroskoop on üks võimsamaid tööriistu loodusteadustes, mis võimaldab uurida valkude või teiste huvipakkuvate molekulide jaotust tänu spetsiifilisele ja tundlikule analüüdi märgistamisele. Kuna fluorestsentsmikroskoopia on üks madalamaid avastamispiire võimaldav spektroskoopiline meetod, siis seetõttu on bioloogiliste molekulide märgistamiseksvälja töötatud väga palju tehnikaid.

Bioloogilised fluorestsentsmärgised

Paljudele bioloogilistele molekulidele on disainitud fluorestsentsmärgised. Ühte märgiste klassi kuuluvad väiksed, sisemiselt fluorestseeruvad ja spetsiifiliselt seostuvad molekulid. Tähtsaimad näited sellistest molekulidest on DAPI ja Hoechst (kuulub siniste fluorestsentsmärgiste perekonda), mis seostuvad DNA väikse vaoga, märgistades seega rakutuuma. Teine suur klass on fluorofooriga derivatiseeritud droogid ja mürkained, mis seostuvad kindlate rakustruktuuridega. Selle klassi parim näide on fluorestsentsmärgistatud falloidiin, mida kasutatakse aktiini filamentide ja imetajarakkude märgistamiseks.

Väga paljud fluorofoorid, näiteks fluorestsiin ja DyLight 488, on võimelised moodustama keemilisi sidemeid erinevate molekulidega, mis seostuvad uuritava ainega proovis.

Immunofluorestsents

Hiire seedetrakti närvitänk märgistatuna roheliselt fluorestseeruva märgisega, sinine värvus on tingitud UV-alas autofluorestseeruvast perifeersetest närvitänkidest. Tegemist on immunohistokeemilise (antikeha-antigeen seostumine) meetodi näitega, kus kujutise saamiseks on kasutatud laseriga konfokaalmikroskoopi

Immunofluorestsentsmeetod baseerub antikehade omadusel seostuda kõrgspetsiifiliselt antigeenidele (enamasti organismile võõrad ained), et märgistada konkreetseid valke või muid aineid rakus. Kõigepealt töödeldakse proovi esmaste antikehadega, et need seostuksid uuritavate ainetega. Kusjuures esmane antikeha võib olla vahetult konjugeeritud fluorofooriga. Alternatiivselt kasutatakse fluorofooridega konjugeeritud sekundaarseid antikehasid, mis seostuvad spetsiifiliselt esmaste antikehadega. Näiteks hiirtes kasvatatud tubuliiniga spetsiifiliselt seostuvaid primaarseid antikehasid, mis on ühinenud fluorofooriga derivatiseeritud sekundaarantikehadega, võib kasutada mikrotuubulite märgistamiseks rakus.

Fluorestsentsvalgud

Tänapäevane arusaamine geneetikast ja DNA modofitseerimise tehnikatest on jõudnud sinnamaani, et teadlased suudavad valke geneetiliselt muundada nii, et proteiinis oleks ka fluorestseeruv valguosa. Tänu sellele on võimalik bioloogilistes proovides sisalduv uuritav aine muuta otseselt fluorestseeruvaks. Seega saab proteiinide asukoha otseselt kindlaks teha ka elusrakkudes.

Piirangud

Fluorofoorid võivad oma fluorestseerumisvõime kaotada kiiritamisega kaasnevas protsessis, seda nimetatakse fotopleekimiseks. Fotopleekimine on molekuli fotokeemiline hävimine ergastuskiirguse tõttu. Selle nähtuse esinemist saab tagasi tõrjuda teatud meetmete abil, milleks on

• fluorofooride kontsentratsiooni suurendamine;
• pealelangeva valguse intensiivsuse vähendamine;
• aja lühendamine, mille jooksul toimub molekuli mõjutamine ergastuskiirgusega;
• pealelangevate footonite energia vähendamine;
• fluorofooride kasutamine, mis pole valguse suhtes nii tundlikud.

Fotopleekimine võib seega tugevalt limiteerida aega, mille jooksul saab uuritavat molekuli jälgida.

Tänu fluorofooridele on võimalik elusrakkude uurimine fluorestsentsmikroskoopias, kuid tuleb silmas pidada, et elusrakud on siiski küllaltki tundlikud kiirguse suhtes, eriti kõrgsagedusliku kiirguse suhtes. Veelgi enam, fluorofooridel on tendents tekitada ergastamisel keemiliselt aktiivseid ühendeid, mis on rakule mürgised.

Erinevalt peegeldumis- ja neeldumissmikroskoopia meetoditest võimaldab fluorestsentsmikroskoopia uurida ainult neid struktuure, mis on fluorestsentsmärgistatud. Näiteks fluorestsentsmärgistatud DNA uurimine rakus võimaldab kindlaks teha ainult DNA paigutuse selles, kuid ei ütle ülejäänud raku morfoloogia kohta midagi.