DE19817081B4 - Filter unit for the multi-stage separation of biological cell suspensions and solutions - Google Patents
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Abstract
Geschlossenes Filtersystem zur Separation von biologischen Zellsuspensionen und Lösungen aus mindestens zwei jeweils mindestens einen Filter aufweisenden Filtermodulen, dadurch gekennzeichnet, daß die Filtermodule (3) über mindestens eine rückflußgesperrte Leitung (5) miteinander verbunden sind, das System (1) Druckzu- und -ableitungen (7,11), Rückhaltefilter (9,15) in den Druckzu- und -ableitungen sowie eine Vakuumpumpe (13) zur Förderung der zu separierenden Zellsuspensionen oder Lösungen und jeweils mindestens einen die Öffnungen der Filtermodule verschließenden Verschluß (17) aufweist, der selbständig schließend ist.Closed filter system for separating biological cell suspensions and solutions from at least two filter modules each having at least one filter, characterized in that the filter modules (3) are connected to one another via at least one non-return line (5), the system (1) pressure supply and discharge lines (7, 11), retention filter (9, 15) in the pressure supply and discharge lines as well as a vacuum pump (13) for conveying the cell suspensions or solutions to be separated and each have at least one closure (17) which closes the openings of the filter modules and which independently is closing.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Filtersystem zur mehrstufigen Separation von biologischen Zellsuspensionen und Lösungen sowie ein Verfahren zur mehrstufigen Separation von biologischen Zellsuspensionen und Lösungen.The present invention relates to a filter system for the multi-stage separation of biological cell suspensions and solutions and a method for the multi-stage separation of biological Cell suspensions and solutions.
Kaskadenartige Filtersysteme zur Blutreinigung (zum Beispiel Hämodialyse, Hämofiltration, Plasmapherese etc.) sind zum Beispiel aus „Blutreinigungsverfahren, Technik und Klinik" ed. H. E. Franz, Georg Thieme Verlag 1990, Seite 581, bekannt. Durch das Hintereinanderschalten von zwei Membranfiltern mit unterschiedlicher Ausschlussgrenze kann im ersten Schritt Plasma von Blut abgetrennt werden und das so separierte Plasma anschließend im zweiten Filtermodul in eine nieder- und eine hochmolekulare Fraktion aufgetrennt werden.Cascade-like filter systems for Blood purification (e.g. hemodialysis, Hemofiltration, plasmapheresis etc.) are for example from "blood purification processes, Technology and clinic "ed. H. E. Franz, Georg Thieme Verlag 1990, page 581. By the series connection of two membrane filters with different ones Exclusion limit can be separated from blood in the first step and the separated plasma in the second filter module be separated into a low and a high molecular weight fraction.
Aus „Handbook of Industrial Membrane Technology" ed. M. C. Porter, Noyes Publications 1990, Seiten 360 bis 362, sind ebenfalls kaskardierbare, das heißt hintereinander geschaltete, Filter bekannt.From "Handbook of Industrial Membrane Technology" ed. M. C. Porter, Noyes Publications 1990, pages 360 to 362, are also cascadable, this means sequential filters known.
In der
Die Separation von biologischen Zellsuspensionen und Lösungen mit Filtern ist bekannt. Bekannt sind auch automatisierbare Ausführungsformen wie Diafiltrationsmodule, die eine effiziente Separation biologischer Materialien ermöglichen. Um eine insbesondere für komplex aufgebaute Suspensionen und Lösungen erforderliche mehrstufige Separation durchzuführen, ist es bekannt, Stecksysteme aus einzelnen Filtermodulen einzusetzen, die manuell zusammengefügt werden. Diese Stecksysteme weisen jedoch den Nachteil auf, daß der Austritt von Aerosolen zum Beispiel in die Umgebung oder benachbarte Filtermodule und Querkontaminationen zwischen den einzelnen Modulen durch die Steckverbindungen möglich sind. Dies liegt daran, daß die bekannten Systeme sogenannte offene Systeme darstellen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß Aerosole aus dem Filtersystem austreten können und zu Querkontaminationen führen können, das heißt zur Verunreinigung benach barter Module des Systems. Derartige Systeme können daher insbesondere in der differentiellen DNA/RNA-Diagnostik nicht eingesetzt werden. Diese Bereiche sind nämlich besonders anfällig für auch minimale Kontaminationen. Tatsächlich sind gegenwärtig keine Filtrationssysteme bekannt, die eine mehrstufige Separation für die DNA/RNA-Diagnostik ermöglichen sowie die bei einer differentiellen Zellaufbereitung eingesetzt werden könnten. In den bekannten Stecksystemen eingesetzte Filter sind nicht, wie für eine differentielle Zellaufbereitung notwendig, zellspezifisch funktionalisiert und die Auftrennung der Zellen oder Partikel erfolgt lediglich aufgrund der Basis von Zell/Partikelgrößen oder aufgrund unspezifischer Wechselwirkungen der Komponenten mit dem Filter. Dabei handelt es sich um allgemein ionische oder hydrophobe Wechselwirkungen, welche den Nachteil haben, daß sie weder hochaffin noch sehr selektiv sind. Darüber hinaus führen solche Wechselwirkungen oft zu Beschädigungen der zu trennenden Komponenten, was insbesondere für eine zu erzielende Differentialdiagnose mit folgenden weiteren Schritten, die eine Vitalität oder Intaktheit der Komponenten erfordern, ungünstig ist.The separation of biological cell suspensions and solutions with filters is known. Automated embodiments are also known like diafiltration modules that efficiently separate biological Enable materials. To one especially for complex suspensions and solutions required multi-stage Carry out separation, it is known to use plug systems from individual filter modules, which are put together manually become. However, these plug-in systems have the disadvantage that the outlet of aerosols, for example, into the environment or neighboring filter modules and cross contamination between the individual modules by the Plug connections possible are. This is because the known systems represent so-called open systems, which thereby are marked that aerosols can emerge from the filter system and lead to cross-contamination can, this means to contaminate neighboring modules of the system. Such systems can therefore especially not in differential DNA / RNA diagnostics be used. These areas are particularly susceptible to even minimal ones Contamination. Indeed are present No filtration systems are known that require a multi-stage separation for the Enable DNA / RNA diagnostics as well as those used in a differential cell preparation could become. Filters used in the known plug-in systems are not how for one differential cell preparation necessary, cell-specific functionalized and the separation of the cells or particles is only due to the basis of cell / particle sizes or due to non-specific interactions of the components with the filter. These are generally ionic or hydrophobic interactions, which have the disadvantage that they are neither highly affine nor very selective. In addition, such lead Interactions often lead to damage of the components to be separated, which is particularly important differential diagnosis with the following further steps, which is a vitality or require the components to be intact, is unfavorable.
Die bekannten Stecksysteme haben auch den Nachteil, daß zum Erhalt der jeweiligen Retentate die Steckverbindungen gelöst werden müssen und die jeweiligen Filtermodule einzeln zu spülen sind. Dies bedeutet einen sehr großen Handhabungsaufwand. Bei der Nutzung ionisch chemischer Wechselwirkungen mit niedriger Affinität müssen zum Ablösen zudem Chemi kalien eingesetzt werden, welche unter Umständen eine besonders aufwendige Handhabung voraussetzen.The known plug systems have also the disadvantage that for Receipt of the respective retentates, the plug connections are released have to and the respective filter modules have to be rinsed individually. This means one very big Handling effort. When using ionic chemical interactions with low affinity have to to peel off chemicals are also used, which may be a require particularly complex handling.
Führt man bei den bekannten Stecksystemen eine Elution der Bestandteile durch das gesamte System durch, so führt dies zu einer Verunreinigung des Zielretentats durch die Elution der anderen Retentate. Schließlich ist die Automatisierbarkeit der bestehenden Stecksysteme nur unter großem technischen Aufwand möglich, da die Steckverbindungen zwischen den einzelnen Modulen dicht gegen Fluide sein müssen, da sonst Flüssigkeit unkontrolliert ausdringt. Aus diesem Grund müssen enge Toleranzen für die Verbindungselemente gewählt werden. Die automatische Herstellung der Steckverbindungen wird durch die engen Toleranzen erschwert.Leads in the known plug-in systems, elution of the components through the entire system, this leads to contamination of the Target retirement by eluting the other retentions. Finally is the automation of the existing plug-in systems only under great technical Effort possible because the plug connections between the individual modules are tight against each other Have to be fluids otherwise liquid escapes uncontrollably. For this reason, tight tolerances for the fasteners chosen become. The automatic establishment of the plug connections is difficult due to the narrow tolerances.
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht also darin, ein Filtersystem zur Verfügung zu stellen, mit dem eine mehrstufige Separation von biologischen Zellsuspensionen und Lösungen, insbesondere von Zellen, Zellorganellen oder Molekülen unterschiedlicher Größe oder Oberflächeneigenschaften, erzielt werden kann, wobei dieses System einfach automatisierbar ist und gleichzeitig bei geringem Handhabungsaufwand Aerosolaustritte oder Querkontaminationen verhindert werden.The basis of the present invention So the technical problem is to have a filter system available with which a multi-stage separation of biological cell suspensions and solutions, especially of cells, cell organelles or molecules of different Size or Surface properties can be achieved, this system is easy to automate is and at the same time with low handling effort aerosol leaks or cross-contamination can be prevented.
Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem durch die Bereitstellung eines Filtersystems zur Separation von biologischen Zellsuspensionen und Lösungen, zum Beispiel Zellaufschlüsse, Zellhomogenate, Protein- oder Peptidlösungen, Körperflüssigkeiten, Polymerlösungen, Lysaten, Bakterien- und/oder Virenhaltige Lösungen usw., aus mindestens zwei jeweils mindestens einen Filter aufweisenden Filtermodulen, wobei die Filtermodule über mindestens eine rückflußgesperrte Leitung miteinander verbunden sind und die mindestens zwei Filtermodule jeweils einen Verschluß aufweisen.The present invention solves this problem by providing a filter system for separating biological cell suspensions and solutions, for example cell disruption, cell homogenates, protein or peptide solutions, body fluids, polymer solutions, lysates, bacteria and / or virus-containing solutions, etc., from at least two each have at least one filter the filter modules, the filter modules being connected to one another via at least one non-return line and the at least two filter modules each having a closure.
Die Erfindung sieht demgemäß ein vorgenanntes Filtersystem vor, das sich durch seinen speziellen Aufbau für eine mehrstufige Separation von biologischen Zellsuspensionen und Lösungen, insbesondere von Zellen, Zellorganellen oder Molekülen unterschiedlicher Größe, unterschiedlicher Spezifität und/oder Oberflächeneigenschaften, besonders gut eignet.The invention accordingly provides an aforementioned Filter system, which is due to its special structure for a multi-stage Separation of biological cell suspensions and solutions, especially of cells, cell organelles or molecules of different Size, different Specificity and / or Surface properties particularly well suited.
Die Erfindung ermöglicht zum Beispiel die differentielle Zellauftrennung für eine anschließende zell- oder gewebespezifische DNA/RNA- oder proteingestützte Diagnostik in automatisierbarer Weise. Zudem ist die Separation von Moleküllösungen oder - suspensionen unterschiedlicher molekularer Eigenschaften möglich, wobei dazu erfindungsgemäß entsprechend funktionalisierte Filter in den Filtermodulen verwendet werden.For example, the invention enables differential Cell separation for a subsequent cell or tissue specific DNA / RNA or protein-based Diagnostics in an automated way. In addition, the separation of molecular solutions or suspensions of different molecular properties possible, according to the invention accordingly Functionalized filters can be used in the filter modules.
Das Filtersystem der vorliegenden Erfindung ist ein geschlossenes System, wobei ein geschlossenes System im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein System ist, bei dem der Austritt von Aerosolen aus einem Filtermodul ausgeschlossen wird, so daß die Gefahr von Verunreinigungen und Querkontaminationen zwischen den unterschiedlichen Filtermodulen und aus dem Filtersystem in die Umgebung beziehungsweise umgekehrt verhindert wird. Das erfindungsgemäße System bietet den Vorteil, daß jede Art von Einzelzellsuspension oder Moleküllösung in das System eingegeben und separiert werden kann. Das erfindungsgemäße Filtersystem bietet darüber hinaus besonders diagnostische Vorteile bei der Eingabe von vitalen beziehungsweise in ihrer Zellmembranstruktur intakten Zellsuspension.The filter system of the present Invention is a closed system, being a closed system System in connection with the present invention a system in which the escape of aerosols from a filter module is excluded is so that the Risk of contamination and cross contamination between the different filter modules and from the filter system into the Environment or vice versa is prevented. The system according to the invention has the advantage that each Type of single cell suspension or molecular solution entered into the system and can be separated. The filter system according to the invention also offers especially diagnostic advantages when entering vital respectively cell suspension intact in its cell membrane structure.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß das Filtersystem sowohl manuell als auch automatisch bedient werden kann und in marktgängige Pipettierplattformen, zum Beispiel einen Pipettierroboter, integrierbar ist. Durch Einsetzen geeigneter Filter in die Filtermodule des erfindungsgemäßen Filtersystems mit entsprechender spezifischer Funktionalisierung oder spezifischen Größen-gestützten Trenneigenschaften, zum Beispiel Tiefenfilter, können PCR-Inhibitoren, zum Beispiel das in den roten Blutkörperchen enthaltene Hämoglobin, mit dem vorliegenden Filtersystem entfernt werden. Das erfindungsgemäße Filtersystem ermöglicht also eine positive Zellanreicherung, wobei Zellen bestimmter Art beziehungsweise Größe angereichert werden und/oder eine negative Zellanreicherung in Form der Abtrennung von störenden Zellbeziehungsweise Molekülkomponenten.Another advantage of the present Invention is that Filter system can be operated both manually and automatically can and in marketable Pipetting platforms, for example a pipetting robot, can be integrated is. By inserting suitable filters into the filter modules of the filter system according to the invention with corresponding specific functionalization or specific size-based separation properties, for example depth filters PCR inhibitors, for example that in the red blood cells contained hemoglobin, can be removed with the present filter system. The filter system according to the invention allows a positive cell enrichment, whereby cells of a certain type or size can be enriched and / or a negative cell enrichment in the form of the separation of disturbing Cell or molecular components.
In bevorzugter Ausführungsform kann vorgesehen sein, das Filtersystem als Wegwerfsystem aus preis günstigen und leicht herstellbaren Bestandteilen, zum Beispiel Kunststoffbestandteilen, herzustellen.In a preferred embodiment can be provided, the filter system as a disposable system from inexpensive and easily manufactured components, for example plastic components, manufacture.
Das Filtersystem ist ferner insofern vorteilhaft, als daß eine manuelle Zellseparation vor einer automatisierten Analytgewinnung für die molekulare Diagnostik entfallen kann. Der erfindungsgemäß vorgesehene Einsatz molekular und spezifisch funktionalisierter Filter im erfindungsgemäßen Filtersystem ermöglicht eine hochspezifische Separation, so daß beispielsweise eine Abtrennung von störenden Erythrocyten sowie des in den Erythrocyten enthaltenen Hämoglobins ohne die Notwendigkeit automatisierungsinkompatibeler Zentrifugationsschritte möglich ist, ebenso wie eine Abtrennung von bestimmten Leukocyt-Subtypen.The filter system is also insofar advantageous than that a manual cell separation before automated analyte extraction for the molecular diagnostics can be omitted. The one provided according to the invention The use of molecularly and specifically functionalized filters in the filter system according to the invention enables one highly specific separation, so that for example a separation of distracting Erythrocytes and the hemoglobin contained in the erythrocytes without the need for automation incompatible centrifugation steps is possible, as well as a separation from certain leukocyte subtypes.
Das erfindungsgemäße Filtersystem sieht vor, daß die einzelnen Filtermodule jeweils einen Verschluß aufweisen, der den Austritt von Aerosolen aus dem Filtersystem verhindert, so daß unter anderem die Gefahr einer Querkontamination beseitigt ist. Eine räumliche Trennung bei der Bearbeitung unterschiedlicher Proben, die vor allem im Bereich der einer Isolierung nachgeschalteten DNA-Amplifizierung mittels PCR notwendig ist, entfällt. Die Erfindung ermöglicht also eine Parallelisierung und Automatisierung der Arbeitsschritte auf einer einzigen Plattform.The filter system according to the invention provides that the individual filter modules each have a closure that the outlet prevented from aerosols from the filter system, so that under the risk of cross-contamination has been eliminated. A spatial Separation when processing different samples, above all in the area of DNA amplification following isolation PCR is not necessary. The invention enables a parallelization and automation of the work steps on a single platform.
Vorteilhaft ist ferner, daß die zurückgehaltenen Substanzen, also das Retentat, von den Filtern gelöst werden können, ohne daß das Filtersystem de montiert werden muß. Aufgrund der Modulstruktur des erfindungsgemäßen Filtersystems ist es also möglich, auf die separierten Substanzen jeweils einzeln zuzugreifen, das heißt sie einzeln zu spülen oder zu eluieren. Dies kann erfindungsgemäß geschehen, ohne daß die Filtermodule voneinander getrennt werden müssen und ohne daß eine Querkontamination zwischen den einzelnen Filtermodulen auftreten kann. Querkontaminationen können aufgrund der erfindungsgemäß vorgesehenen Verschlüsse und rückflußgesperrten Leitungen nicht auftreten. Das bedeutet, daß ohne Demontageschritte auf die einzelnen Separationseinheiten zugegriffen werden kann und dabei keine Steckverbindungen gelöst oder hergestellt werden müssen. Dies ermöglicht eine Verkürzung der Bearbeitungszeit und erlaubt eine vereinfachte Automatisierung.It is also advantageous that the restrained Substances, i.e. the retentate, are released from the filters can, without that Filter system must be installed. Due to the modular structure of the filter system according to the invention so is it possible to access the separated substances individually, that is called to rinse them individually or elute. This can be done according to the invention without the filter modules must be separated from each other and without one Cross contamination between the individual filter modules can occur. Cross-contamination can due to the provided according to the invention closures and non-return valves Lines do not appear. This means that without dismantling steps the individual separation units can be accessed while doing so no plug connections loosened or have to be manufactured. this makes possible a shortening processing time and allows simplified automation.
Das erfindungsgemäße Filtersystem sieht ferner die Verwendung von rückflußgesperrten Leitungen zwischen den einzelnen Filtermodulen vor, und zwar in einer Art und Weise, daß ein Rückfluß, das heißt ein Fluß entgegen der Separationsrichtung, der zu bearbeitenden beziehungsweise der bereits bearbeiteten Suspension oder Lösung vermieden wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann vorgesehen sein, daß die Rückflußsperrung dadurch erreicht wird, daß der höchste Punkt der zwischen den Modulen angeordneten Leitungen über der maximalen Füllhöhe der Filtermodule liegt. Erfindungsgemäß kann aber auch vorgesehen sein, daß die Leitungen zwischen den Modulen Ventile aufweisen, die einen Durchfluß nur in einer Richtung, nämlich der Separationsrichtung, erlauben. Schließlich kann ein Rückfluß auch durch die räumliche Anordnung der Filtermodule zueinander verhindert werden, indem die Schwerkraft zur Beförderung der zu separierenden Suspension oder Lösung eingesetzt wird und das jeweils nächstfolgende Filtermodul unterhalb des davor gelegenen Filtermoduls angeordnet ist. Die Schwerkraft verhindert so einen Rückfluß entgegen der Separationsrichtung.The filter system according to the invention also provides for the use of non-return lines between the individual filter modules, in such a way that a backflow, that is to say a flow against the direction of separation, of the suspension or solution to be processed or of the already processed is avoided. In a particularly preferred embodiment of the invention it can be provided that the non-return valve is achieved in that the highest point of the lines arranged between the modules lies above the maximum fill level of the filter modules. According to the invention, however, it can also be provided that the lines between the modules have valves which only flow in one direction, namely the direction of separation. allow. Finally, backflow can also be prevented by the spatial arrangement of the filter modules in relation to one another, by using gravity to convey the suspension or solution to be separated and by arranging the next filter module below the filter module located in front of it. Gravity thus prevents backflow against the direction of separation.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, daß die Filtermodule mit einem Verschluß verschlossen sind, der in bevorzugter Ausführungsform der Erfindung so gestaltet ist, daß er sich nach der Zugabe oder Entnahme von Flüssigkeit wieder selbständig schließt. Der Verschluß kann beispielsweise als Septum ausgeführt sein. Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, daß das Septum mit einer Nadel oder Pipettenspitze durchstoßbar ist, um beispielsweise Suspensionen oder Spül- beziehungsweise Elutionsflüssigkeiten in das Filtersystem einzubringen. Das Septum schließt sich anschließend von selbst. Von Bedeutung für die Art und Beschaffenheit des Verschlusses ist, daß dieser zuverlässig den Austritt von Aerosolen verhindert und gleichzeitig auch die Entnahme oder Zugabe von Flüssigkeiten in das Filtermodul ermöglicht, ohne daß es zum Aerosolaustritt kommt.In a particularly preferred embodiment the invention provides that the filter modules with a Closure closed are, in a preferred embodiment the invention is designed so that it is after the addition or Withdrawal of liquid independent again closes. The Closure can for example as a septum his. According to the invention, that this Septum can be pierced with a needle or pipette tip, for example suspensions or rinsing or elution liquids in the filter system. The septum closes subsequently by itself. Of importance for the type and nature of the closure is that of this reliable prevents the escape of aerosols and at the same time also prevents Removal or addition of liquids into the filter module allows without it comes to the aerosol outlet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, daß die Förderung der Suspension oder Lösung durch die Filtermodule und die Leitungen mittels einer Druckdifferenz erzielt wird, die beispielsweise mittels einer Vakuumpumpe aufgebaut wird. Erfindungsgemäß ist in bevorzugter Ausführungsform vorgesehen, den erforderlichen Druckausgleich durch Druckzu- beziehungsweise Druckableitungen zu erreichen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, die Druckzu- beziehungsweise -ableitung jeweils mit einem Rückhaltefilter für Aerosole auszustatten. Derartige Filter sind also sowohl bei der Druckzuleitung, also der Leitung zwischen Umgebung und erstem Filtermodul, als auch bei der Druckableitung, also der Leitung zwischen dem letzten Filtermodul und der Vakuumpumpe, vorgesehen. Die Verwendung der Aerosolfilter in den Druckzu- und -ableitungen und die der Verschlüsse der einzelnen Filtermodule führt zur Bildung eines geschlossenen Systems, das in vorteilhafter Weise die Gefahr von Verunreinigungen, also Querkontaminationen und Aerosolaustritt, verhindert.In a further preferred embodiment the invention provides that the promotion of the suspension or solution is achieved by means of a pressure difference through the filter modules and the lines, which is built up for example by means of a vacuum pump. According to the invention in preferred embodiment provided the necessary pressure equalization by pressure increase or To achieve pressure derivatives. In a particularly preferred embodiment the invention provides for the pressure supply or discharge each with a retention filter for aerosols equip. Such filters are therefore used both for the pressure supply line, So the line between the environment and the first filter module, as well for pressure discharge, i.e. the line between the last filter module and the vacuum pump. The use of the aerosol filter in the print feed and leads and closures of the individual filter modules to form a closed system that advantageously the risk of contamination, i.e. cross-contamination and aerosol leakage, prevented.
Das erfindungsgemäße Filtersystem umfaßt mindestens zwei Filtermodule, wobei je nach Zahl der gewünschten Separationsschritte die Zahl der Filtermodule beliebig variiert werden kann.The filter system according to the invention comprises at least two filter modules, depending on the number of separation steps required the number of filter modules can be varied as desired.
Die Art der eingesetzten Filter, die im Fall des Einsatzes von einem Filter pro Modul das Modul in zwei Kammern trennt, richtet sich nach den Größen- und/oder Oberflächeneigenschaften der aufzutrennenden Zellen oder Moleküle. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, in einer bevorzugten Ausführungsform Filter mit spezifischen molekularen Belegungen herzustellen und im Filtersystem einzusetzen. Diese Be legungen werden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch als spezifische Funktionalisierung bezeichnet und dienen nach dem "Schlüssel-Schloß"-Prinzip der spezifischen Erkennung und Immobilisierung eines Zielretentats im oder auf dem Filter. Als Belegungen kommen im wesentlichen alle Substanzen in Betracht, die auch bei der Affinitätschromatographie Anwendung finden können. Die Belegung kann in Form von Proteinen wie Antikörpern, Rezeptoren, Integrinen oder anderen Oberflächenproteinen mit zellbindenden Eigenschaften sowie auch durch kleinmolekulare Peptidsequenzen mit zellbindenden Eigenschaften ausgeführt sein, wobei diese Peptide Teilen der obengenannten Proteinen entsprechen können. Die Belegung kann auch mit Kohlenhydraten oder Kohlenhydratderivaten von Proteinen erfolgen ebenso wie zur Isolierung von Antikörpern spezifische Antigene oder zur Isolierung von einzelsträngigen Nucleinsäuren die komplementären Einzelstränge eingesetzt werden können. Die Belegung oder Funktionalisierung der Filter erfolgt in bevorzugter Ausführungsform chemisch über bekannte Verfahren. Demgemäß kann eine Adaptierung der Filteroberfläche durch Plasmaverfahren durchgeführt werden, wobei gegebenenfalls eine Aktivierung für die weiteren Belegungsschritte sowie auch eine Desaktivierung zur Reduzierung störender unspezifischer Bindungskräfte notwendig sein kann. Erfindungsgemäß möglich ist es selbstverständlich auch, Spacer oder Linker zur Bindung der Belegungen an den Filter vorzusehen oder eine sonstige Ankopplung der Belegung vorzunehmen.The type of filter used, which in the case of using one filter per module, the module in two Separating chambers depends on the size and / or surface properties of the ones to be separated Cells or molecules. According to the invention, in a preferred embodiment filter with specific molecular assignments and in the filter system use. These assignments are in connection with the present Invention also referred to as specific functionalization and serve according to the "key-lock" principle of specific Detection and immobilization of a target retirement in or on the filter. Essentially all substances can be considered as assignments, which also applies to affinity chromatography Can find application. The assignment can be in the form of proteins such as antibodies, receptors, Integrins or other surface proteins with cell-binding properties as well as with small molecules Peptide sequences with cell-binding properties, these peptides corresponding to parts of the above proteins can. The allocation can also be with carbohydrates or carbohydrate derivatives proteins as well as for the isolation of antibodies are specific Antigens or for the isolation of single-stranded nucleic acids complementary single strands can be used. The assignment or functionalization of the filters is carried out in a preferred manner embodiment chemically over known methods. Accordingly, one Adaptation of the filter surface performed by plasma processes be, if necessary an activation for the further allocation steps as well as a deactivation to reduce disturbing non-specific binding forces may be necessary. According to the invention it is of course also possible To provide spacers or linkers for binding the assignments to the filter or make another connection to the assignment.
Die Erfindung sieht in bevorzugter Ausführungsform also vor, spezifische Funktionalisierungen oder Belegungen aufweisende Filter einzusetzen, also Filter, die beispielsweise zellspezifische Rezeptoren, Integrine, Antikörper oder ähnliches aufweisen.The invention looks more preferred embodiment that is, specific functionalizations or assignments Use filters, i.e. filters that are cell-specific, for example Receptors, integrins, antibodies or similar exhibit.
Die eingesetzten Filter können auch Filter sein, die unspezifisch bestimmte Oberflächeneigenschaften der zu separierenden Zellen, Zellorganelle oder Moleküle zur Retention am Filter nutzen, wie deren hydrophoben oder hydrophilen Charakter.The filters used can also Filters that are non-specific surface properties of the one to be separated Cells, cell organelles or molecules use for retention on the filter, such as their hydrophobic or hydrophilic Character.
Selbstverständlich sieht die Erfindung auch den Einsatz von Filtern in den Filtermodulen vor, die einer Größen-/Tiefenfiltration dienen. Erfindungsgemäß sind auch spezielle Tiefenfilter beispielsweise zur Abtrennung von Erythrocyten einsetzbar.Of course, the invention sees also the use of filters in the filter modules, which one Size / depth filtration serve. According to the invention special depth filters, for example to separate erythrocytes used.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, in dem Filtersystem unterschiedliche Filter einzusetzen. Die Erfindung sieht also in bevorzugter Weise in einem Filtersystem die Kombination von Filtermodulen vor, die jeweils unterschiedliche Filter aufweisen, beispielsweise Filter unterschiedlicher Größe oder unterschiedlicher Belegung beziehungsweise Funktionalisierung. Erfindungsgemäß kann beispielsweise in einer dreistufigen Separation vorgesehen sein, in einem ersten Filtermodul einen Filter mit der Filtergröße von beispielsweise 5μm vorzusehen, der gewebespezifisch so funktionalisiert wurde, daß als Zielzellen Leukocyten in dieser Stufe gewonnen werden, in einer zweiten Separationsstufe findet das zweite Filtermodul mit einem Tiefenfilter Anwendung, wobei im Retentat zelluläre Inhibitoren angereichert werden und das Permeat in einer dritten Separationsstufe einem dritten Filtermodul mit einem Filter der Filtergröße von beispielsweise 2μm zugeführt wird, das der Gewinnung von Viren und Bakterien dienen kann, wobei sich im Permeat dieser letzten Separationsstufe die Viren befinden.In a particularly preferred embodiment the invention provides for different filter systems Insert filter. The invention therefore looks in a preferred manner in a filter system the combination of filter modules that each have different filters, for example filters different size or different occupancy or functionalization. According to the invention, for example, be provided in a three-stage separation, in a first To provide a filter module with a filter size of, for example, 5 μm, which is tissue-specific was so functionalized that Target cells in this stage are obtained in a leukocyte second separation stage finds the second filter module with a Depth filter application, with cellular inhibitors enriched in the retentate and the permeate in a third separation stage a third Filter module with a filter of the filter size of, for example, 2 μm is supplied, which can be used for the extraction of viruses and bacteria, whereby the viruses are in the permeate of this last separation stage.
Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, mehr als einen Filter pro Filtermodul einzusetzen, so daß das Filtermodul dementsprechend mehrere Kammern aufweist.According to the invention, it can also be provided that use more than one filter per filter module so that the filter module accordingly has several chambers.
Die Erfindung sieht ferner in bevorzugter Ausführungsform vor, daß das Spülen und/oder Eluieren des Retentats von den Filtern entweder durch Zugabe von Lösungen von oben auf die Filteroberseite oder von unten auf die Filterunterseite erreicht wird. Erfindungsgemäß wird in besonders bevorzugter Art und Weise eine Elution durch Zugabe der Elutionslösung auf die Filteroberseite durchgeführt. Erfindungsgemäß ist, wie bereits erwähnt, vorgesehen, die für die Zugabe der Lösungen erforderlichen Öffnungen in den Filtermodulen nicht ständig offenzuhalten, sondern mit einem Verschluß zu versehen, und zwar so, daß ein selbsttätiges Verschließen nach Lösungszugabe oder -entnahme möglich ist.The invention also provides a preferred embodiment before that do the washing up and / or eluting the retentate from the filters either by addition of solutions from above to the top of the filter or from below to the bottom of the filter is achieved. According to the invention in a particularly preferred way of elution by adding the elution performed on the top of the filter. According to the invention is how already mentioned, provided for the addition of the solutions required openings not in the filter modules all the time to keep open, but to provide a closure, in such a way the existence automatic close after adding a solution or removal possible is.
Erfindungsgemäß ist ferner vorgesehen, die separierten Bestandteile, das heißt beispielsweise Zellen, Zellorganelle oder Moleküle, je nach Separtionsweise, nach der Elution entweder aus dem Volumen oberhalb oder unterhalb des Filters zu entnehmen, beispielsweise mit einer Pipette.According to the invention, the separated ones are also provided Components, that is for example cells, cell organelles or molecules, depending on the type of separation, after elution either from the volume above or below the filter, for example with a pipette.
In besonders bevorzugter Ausführungsform betrifft die Erfindung ein vorgenanntes Filtersystem, das automatisiert ist. Wie erwähnt, ist die Automatisierung des erfindungsgemäßen Filtersystems unter anderem deswegen möglich, weil kein manuelles Auseinandernehmen oder Zusammenstecken einzelner Filtermodule vor beziehungsweise nach jedem Separationsschritt beziehungsweise jeder Separationsaufgabe notwendig ist und Querkontaminationen nicht auftreten können. Das erfindungsgemäße Filtersystem kann integrativer Bestandteil eines automatischen Filtersystems sein, das sich für eine Vielzahl von verschiedenen Separationsaufgaben eignet, wobei eine variable Anzahl von Separationsschritten je nach Separationsaufgabe vorgesehen sein kann. In bevorzugter Weise ist in einem automatisierten Filtersystem vorgesehen, das vorstehend beschriebene System auf einer Plattform mit einer automatischen Pipettiervorrichtung, insbesondere einem Pipettierroboter, anzuordnen und/oder zum Beispiel pro Filtermodul jeweils mindestens eine festinstallierte Flüssigkeitszugabe- und -entnahmevorrichtungen, zum Beispiel Kanülen, sowohl bis oberhalb als auch bis unterhalb des Filters in die Filtermodule, das heißt in jede Kammer des Moduls, einzuführen und anzuordnen. Jede dieser Zugabe- beziehungsweise Entnahmevorrichtungen ist mit einem Aerosolfilter versehen und kann, verbunden mit einer Pumpvorrichtung, zentral gesteuert zu separierende Zellsuspensionen oder Lösungen zugeben, separierte Bestand teile abnehmen oder Spülflüssigkeit zugeben. Die Ansteuerung der zur Erzeugung der Druckdifferenz notwendigen Pumpvorrichtung sowie der Pumpvorrichtung für die Zugabe- und Entnahmevorrichtungen kann zentral über einen vom Anwender für die jeweilige Separationsaufgabe programmierbaren Computer erfolgen. Auf diese Weise wird erreicht, daß ein mehrstufiger Separationsprozeß, beispielsweise zur Anreicherung und Trennung von Zellen und/oder Nucleinsäuren, möglich wird, der keinerlei manuelle Handhabungsschritte mehr erfordert.In a particularly preferred embodiment relates the invention is an aforementioned filter system that is automated. As mentioned, is the automation of the filter system according to the invention, among others therefore possible because there is no manual disassembly or assembly of individual ones Filter modules before or after each separation step or Every separation task is necessary and cross-contamination is not may occur. The filter system according to the invention can be an integral part of an automatic filter system be that for a variety of different separation tasks, where a variable number of separation steps depending on the separation task can be provided. Is preferably in an automated Filter system provided, the system described above a platform with an automatic pipetting device, in particular a pipetting robot to arrange and / or for example per filter module at least one permanently installed liquid addition and withdrawal device, for example cannulas, both up above and below the filter in the filter modules, the is called to introduce and arrange in each chamber of the module. Any of these Adding or removing devices is with an aerosol filter provided and can, connected to a pumping device, centrally add controlled cell suspensions or solutions to be separated, Remove separated components or add rinsing liquid. The control the pump device required to generate the pressure difference and the pumping device for the addition and removal devices can be controlled centrally via one by the user for the respective separation task is done by programmable computers. In this way it is achieved that a multi-stage separation process, for example for the enrichment and separation of cells and / or nucleic acids, that no longer requires any manual handling steps.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann, insbesondere in der automatisierten Ausführungsform, vorgesehen sein, die Filtermodule nicht nur linear hintereinander geschaltet, sondern auch verzweigt anzuordnen. Die Anordnung von Verzweigungsstellen in den Leitungen zwischen den Filtermodulen erhöht die Flexibilität des Filtersystems und ermöglicht die gleichzeitige Aufreinigung einer erhöhten Anzahl von Bestandteilen. Alternativ zu der Anordnung einer Verzweigungsstelle in der Leitung kann auch vorgesehen sein, daß aus einem Filtermodul, beispielsweise einer Kammer, mehrere Leitungen zu weiteren Filtermodulen führen.In a particularly preferred embodiment the invention, especially in the automated embodiment, be provided, the filter modules not only linearly one after the other switched, but also to be branched. The arrangement of Branches in the lines between the filter modules elevated the flexibility of the filter system and enables the simultaneous purification of an increased number of components. As an alternative to the arrangement of a branch point in the line can also be provided that a filter module, for example a chamber, several lines lead to further filter modules.
Das erfindungsgemäße Filtersystem ermöglicht die mehrstufige automatisierungsgerechte differentielle Separation von heterogenen zellulären und/oder molekularen Bestandteilen, die in Flüssigkeiten suspendiert oder gelöst sind und die durch Aerosole zu Querkontaminationen führen könnten. Die Separation erfolgt wie erwähnt entweder aufgrund der Größe der Bestandteile oder über die molekularen Eigenschaften der Bestandteile, wobei dann eine entsprechende spezifische Funktionalisierung der Filteroberflächen notwendig ist. Die Erfindung erweist sich demgemäß als besonders vorteilhaft bei der DNA- und RNA-Analyse, der Diagnostik von Infektionskrankheiten, der Forensik, der onkologischen Diagnostik und der Erbkrankheitendiagnostik.The filter system according to the invention enables multilevel automation-compatible differential separation of heterogeneous cellular and / or molecular components suspended in liquids or solved and which could lead to cross-contamination through aerosols. The separation takes place as mentioned either due to the size of the components or about the molecular properties of the components, with a corresponding one specific functionalization of the filter surfaces is necessary. The invention accordingly proves to be special advantageous for DNA and RNA analysis, diagnosis of infectious diseases, forensics, oncological diagnostics and genetic disorders diagnostics.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur mehrstufigen Anreicherung und Auftrennung von Zellen, Zellorganellen und/oder Molekülen, wie Nucleinsäuren, wobei ein Filtersystem, vorzugsweise ein automatisiertes Filtersystem, der vorstehend genannten Art eingesetzt wird und in einer Abfolge der Verfahrensschritte Zugabe der Probe in ein Filtermodul, Filtration, gegebenenfalls Spülen und Elution sowie Entnahme des eluierten Retentats oder des Permeats die separierten Bestandteile erhalten werden. In einem derartigen Verfahren kann vorgesehen werden, daß die in dem Filtersystem eingesetzten Filter spezifisch funktionalisierte Filter sind, die beispielsweise zellspezifische Rezeptoren, Integrine oder Antikörper auf den Filteroberflächen aufweisen.The invention also relates to a method for the multi-stage enrichment and separation of cells, cell organelles and / or molecules, such as nucleic acids, a filter system, preferably an automated filter system, of the aforementioned type being used, and adding the sample to a filter module in a sequence of process steps Filtration, optionally rinsing and elution and removal of the eluted retentate or the permeate the separated components are obtained. In a method of this type it can be provided that the filters used in the filter system are specifically functionalized filters, for example cell-specific receptors, integrins or An have antibodies on the filter surfaces.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.Further advantageous configurations the invention emerge from the subclaims.
Die Erfindung wird anhand eines Ausführungsbeispieles und der dazugehörigen Figur näher erläutert.The invention is based on an embodiment and the associated one Figure explained in more detail.
Die Figur zeigt ein erfindungsgemäßes Filtersystem und seine Bestandteile.The figure shows a filter system according to the invention and its components.
Beispiel: Aufbau und Verwendung des erfindungsgemäßen FiltersystemExample: structure and use of the filter system according to the invention
Die Figur zeigt den Aufbau des erfindungsgemäßen Filtersystems
Jedes Filtermodul
In der Figur sind ferner Filter
Der Einsatz des Filtersystems
Zunächst
werden Einzelzellsuspensionen oder homogene Moleküllösungen vorbereitet.
Die in den Filtermodulen
First, single cell suspensions or homogeneous molecular solutions are prepared. The one in the filter modules
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