DE19901381A1

DE19901381A1 - Method and device for the optical detection of a particle

Info

Publication number: DE19901381A1
Application number: DE19901381A
Authority: DE
Inventors: Joerg Enderlein
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-01-15
Filing date: 1999-01-15
Publication date: 2000-07-20
Also published as: WO2000041457A3; EP1151274A2; WO2000041457A2

Abstract

The invention relates to a method for detecting individual molecules. The method makes it possible to obtain an extremely good signal-to-noise ratio using non-linear optical effects. A sample support (5) is covered with a layer (4). Said layer has optically non-linear properties, and in particular is suitable for frequency doubling. A molecule of dye (2) is immobilised on the layer (4)and a laser beam (1) is focused onto the molecule through the sample support with limited diffraction. The wavelength of the laser beam corresponds to double the absorption wavelength of the dye molecule. The polarisation of the laser beam is selected according to the strong non-linear susceptibility coefficients of the second order of the optically non-linear layer. In the layer, the frequency of the focused laser light is partially doubled, resulting in a dipolar vibration in the layer at the double frequency. This transfers energy in the near field to the molecule. The emission of the molecule can be detected. The excitation of the dye molecule with the frequency-doubled radiation results in a considerable difference in the wavelengths between the excitation light and the fluorescent emission light. This enables these two signals to be clearly separated and ensures an almost background-free detection of the individual particles.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur optischen Detek tion eines Partikels.The invention relates to an apparatus and a method for optical detection tion of a particle.

Die optische Detektion einzelner Moleküle ist eine etablierte Technik mit gro ßem Potential für chemo- und bioanalytische Anwendungen. Eine Überblick über die optische Detektion einzelner Moleküle in Flüssigkeiten und auf Oberflächen und de ren Anwendungen in Chemie, Biologie und Nanotechnologie findet man z. B. in der Übersichtsarbeit von Nie und Zare [S. M. Nie und R. N. Zare, "Optical detection of single molecules", Annual Review of Biophysical and Biomolecular Structure 26, 567-596, 1997]. Besonders die Detektion und Spektroskopie einzelner Moleküle auf Oberflächen ist von großer Bedeutung für Anwendungen wie hochempfindliches und schnelles Screening in der Bioanalytik oder bei der hochempfindlichen und schnellen Durchmusterung großer Molekülbibliotheken, wie sie in der kombinatorischen Che mie vorkommen. Oberflächen bieten dabei die Möglichkeit, Moleküle an diesen aus einer Lösung aufzukonzentrieren und gleichzeitig in einer Ebene räumlich zu fixieren.Optical detection of individual molecules is an established technique with large potential for chemical and bioanalytical applications. An overview of the optical detection of individual molecules in liquids and on surfaces and de Ren applications in chemistry, biology and nanotechnology can be found e.g. B. in the Review by Nie and Zare [p. M. Nie and R. N. Zare, "Optical detection of single molecules ", Annual Review of Biophysical and Biomolecular Structure 26, 567-596, 1997]. Especially the detection and spectroscopy of individual molecules Surfaces is of great importance for applications such as highly sensitive and rapid screening in bioanalytics or in highly sensitive and fast Screening of large molecular libraries, as described in combinatorial Che occur. Surfaces offer the possibility of molecules on them concentrate a solution and at the same time fix it spatially on one level.

Das Standardverfahren zur optischen Detektion von Molekülen auf Oberflächen arbeitet nach dem Prinzip der konfokalen Mikroskopie: Ein Laserstrahl wird durch ein Mikroskopobjektiv hoher numerischer Apertur beugungsbegrenzt auf die Oberfläche fokussiert. Die optische Emission von Molekülen, die sich im Fokus befinden und durch den Laserstrahl angeregt werden, wird über das gleiche Objektiv gesammelt und über eine räumliche Blende und optische Filter auf einen Einzelphotonen-empfindli chen Photodetektor abgebildet [X. S. Xie, "Single molecule spectroscopy and dyna mics at room-temperature", Accounts of Chemical Research 29(12), 598-606, 1996]. Durch Scannen des Laserfokus über die Oberfläche können dann nacheinander die auf der Oberfläche befindlichen Moleküle detektiert und gegebenenfalls deren optische Eigenschaften (Emissionsspektrum, Zeitabklingverhalten bei gepulster Anregung o. ä.) untersucht werden. In Modifikation dieses Standardaufbaus kann die optische Detek tion auch auf der der Anregung gegenüberliegenden Oberflächenseite erfolgen. Die Anregung durch den Laserstrahl kann auch in Totalreflexion oder unter einem anderen Einfallswinkel als 90° erfolgen. Wesentlich ist in jedem Fall, daß die Detektion kon fokal erfolgt, daß also der Photodetektor ein möglichst kleines Raumgebiet sieht, da das Hintergrundsignal (Rayleigh- und Ramanstreuung) proportional zum Volumen des vom Photodetektor gesehenen Raumgebietes ansteigt, während das optische Signal eines einzelnen Moleküls unverändert bleibt. Nachteilig bei diesem Verfahren ist sei ne beschränkte räumliche Auflösung, welche im wesentlichen durch die Ausdehnung des auf der Oberfläche gebildeten Laserfokus gegeben ist, der nicht kleiner als der Abbe-Limit der fokussierenden Optik sein kann. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß für die meisten Moleküle die Emissionswellenlänge spektral nicht sehr weit ent fernt von der Anregungswellenlänge ist, so daß es schwierig ist, die Molekülemission hinreichend gut gegen die Rayleigh- und Ramanstreuung des Anregungslichts zu dis kriminieren.The standard method for the optical detection of molecules on surfaces works on the principle of confocal microscopy: a laser beam is passed through a Microscope objective high numerical aperture diffraction limited to the surface focused. The optical emission of molecules that are in focus and are excited by the laser beam, is collected through the same lens and via a spatial aperture and optical filters to a single photon sensitive Chen photodetector imaged [X. S. Xie, "Single molecule spectroscopy and dyna mics at room temperature ", Accounts of Chemical Research 29 (12), 598-606, 1996]. By scanning the laser focus over the surface, you can then successively focus on Molecules located on the surface are detected and, if necessary, their optical Properties (emission spectrum, time decay behavior with pulsed excitation or similar) to be examined. In a modification of this standard structure, the optical detec tion also take place on the surface side opposite to the excitation. The Excitation by the laser beam can also be in total reflection or under another Incidence angle than 90 °. It is essential in any case that the detection con focal is that the photodetector sees the smallest possible spatial area, because the background signal (Rayleigh and Raman scattering) proportional to the volume of the spatial area seen by the photodetector increases while the optical signal of a single molecule remains unchanged. It is a disadvantage of this method ne limited spatial resolution, which is essentially due to the expansion of the laser focus formed on the surface is not less than that Abbe limit of the focusing optics can be. Another disadvantage is that for most molecules the emission wavelength is not very far spectrally is far from the excitation wavelength so that it is difficult to measure the molecular emission sufficiently good against the Rayleigh and Raman scattering of the excitation light to dis to criminalize.

In der Literatur wurde vorgeschlagen, den Effekt der lokalen Verstärkung eines elektromagnetischen Feldes in der Nähe metallischer Spitzen auszunutzen [L. Novot ny, E. J. Sanchez, X. S. Xie, "Near-field optical imaging using metal tips illuminated by higher-order Hermite-Gaussian beams", Ultramicroscopy 71(1-4), 21-9, 1998]. Dabei wird der anregende Laserstahl auf die Spitze der Sonde eines Atomkraft- oder Elek tronentunnelmikroskops fokussiert, wobei die Feldstärke des elektromagnetischen Fel des in der Nähe der Spitze mehrere Größenordnungen höher sein kann als diejenige des anregenden Laserlichts. Mit diesem stark lokalisierten Feld sollen dann einzelne Moleküle optisch angeregt werden. Nachteil der Methode ist, daß trotz der hohen Feldkonzentration nahe der Spitze auch die weitere Umgebung der Spitze vom Laser licht angeregt wird, was zu einer Verwaschung der räumlichen Auflösung führen kann. Ein ganz besonderer Nachteil besteht in folgendem: Die durch den Laser ange strahlte Spitze verstärkt besonders diejenigen Feldkomponenten, welche parallel zur Spitzenachse sind. Das bedeutet, daß besonders Moleküle optisch angeregt werden, deren Absorptionsdipol ebenfalls parallel zur Spitzenachse orientiert ist. Der Emissi onsdipol der meisten Moleküle ist aber nicht wesentlich zum Absorptionsdipol ge neigt, was dazu führt, daß der elektromagnetische Effekt, welcher zur Feldkonzentra tion nahe der Spitze führt, auch die optische Emission eines nahegelegenen Moleküls effizient löscht. Damit ist die Realisierung eines solchen Mikroskopprinzips für die optische Detektion einzelner Moleküle generell fraglich. In the literature it has been suggested the effect of local amplification to exploit the electromagnetic field in the vicinity of metallic tips [L. Novot ny, E. J. Sanchez, X. S. Xie, "Near-field optical imaging using metal tips illuminated by higher-order Hermite-Gaussian beams ", Ultramicroscopy 71 (1-4), 21-9, 1998] the stimulating laser steel is placed on the tip of the probe of a nuclear power or elec Tron tunnel microscope focused, the field strength of the electromagnetic field which can be several orders of magnitude higher than that near the tip of the exciting laser light. With this highly localized field, individuals should then Molecules are excited optically. The disadvantage of the method is that despite the high Field concentration near the tip also the wider area around the tip from the laser light is stimulated, which leads to a blurring of the spatial resolution can. A very special disadvantage is the following: The laser beamed tip particularly strengthens those field components which are parallel to the Top axis are. This means that especially molecules are optically excited, whose absorption dipole is also oriented parallel to the tip axis. The Emissi The dipole of most molecules is not essential to the absorption dipole tends, which leads to the electromagnetic effect, which leads to the field concentration tion near the tip also leads to the optical emission of a nearby molecule efficiently deletes. This is the realization of such a microscope principle for the optical detection of individual molecules is generally questionable.

Ein Verfahren, was der hier vorgestellten Erfindung am nächsten kommt, wurde in [H. M. Hertz, L. Malmqvist, L. Rosengren, K. Ljungberg, "Optically trapped non linear particles as probes for scanning near-field optical microscopy", Ultramicrosco py 57(2-3), 309-12, 1995] beschrieben. Dabei wurde ein mikroskopischer Kristall mit nichtlinearen optischen Eigenschaften durch eine optische Pinzette über einer zu un tersuchenden Oberfläche gehalten und im Kristall das eingestrahlte Anregungslicht frequenzverdoppelt, so daß somit auf der doppelten Frequenz der Anregungswellen länge eine Lichtquelle mit der Ausdehnung des nichtlinearen Kristalls erzeugt wurde. Dieser Kristall wurde über die Oberfläche geführt und die Lichtabsorption der Ober fläche räumlich hochauflösend vermessen. Theoretisch könnte man mit diesem Ver fahren auch die Fluoreszenz einzelner Moleküle anregen. Nachteilig bei diesem Ver fahren ist der hohe technische Aufwand der optischen Pinzette. Es läßt sich auch nur dann anwenden, wenn das optisch nichtlineare Medium ein Festkörper ist. Durch die ständig sich ändernde Orientierung des Kristalls in der optischen Pinzette ändert sich auch ständig die Konversionseffizienz bei der Frequenzverdopplung. Es kann sich auch als problematisch erweisen, den Kristall beim Scannen hinreichend nah an ober flächenimmobilisierte Moleküle heranzuführen und dort zu halten. Durch die Brown sche Bewegung ändert sich bei kleinen Kristallen ständig der Abstand zwischen Mo lekül und Kristall, was für einen effizienten Energietransfer, welcher zur sechsten Po tenz der Entfernung abnimmt, kritisch sein kann. Wesentlich nachteiliger in einer praktischen Anwendung dürften Probleme wie die unerwünschte Adhäsion des Kri stalls an der Oberfläche, Kontamination des Kristalls durch sich von der Oberfläche ablösende Moleküle und ständige Veränderung der Parameter der optischen Falle auf grund wechselnder optischer Eigenschaften der Oberfläche sein.A method has been developed that comes closest to the invention presented here in [H. M. Hertz, L. Malmqvist, L. Rosengren, K. Ljungberg, "Optically trapped non linear particles as samples for scanning near-field optical microscopy ", Ultramicrosco py 57 (2-3), 309-12, 1995]. A microscopic crystal was used nonlinear optical properties by means of optical tweezers over one too un tersearching surface and the excitation light radiated in the crystal frequency doubled, so that thus at twice the frequency of the excitation waves length a light source with the expansion of the nonlinear crystal was generated. This crystal was passed over the surface and the light absorption of the upper measure the area spatially with high resolution. Theoretically, this ver also stimulate the fluorescence of individual molecules. A disadvantage of this Ver driving is the high technical effort of the optical tweezers. It can only be apply when the optically nonlinear medium is a solid. Through the constantly changing orientation of the crystal in the optical tweezers changes also the conversion efficiency in frequency doubling. It can Also turn out to be problematic when scanning the crystal sufficiently close to the top to bring in and hold surface-immobilized molecules. Through the Brown With small crystals, the distance between Mo changes constantly lekül and crystal, what an efficient energy transfer, which to the sixth bottom distance decreases, can be critical. Much more disadvantageous in one Practical application are likely to cause problems such as the undesired adhesion of the kri stall on the surface, contamination of the crystal by itself from the surface detaching molecules and constant changes in the parameters of the optical trap due to changing optical properties of the surface.

Aufgabe der Erfindung ist es, einzelne Partikel mit hoher räumlicher Auflösung und einem hohen Signal-zu-Rauschen-Verhältnis optisch auf Oberflächen zu detektie ren.The object of the invention is to separate individual particles with high spatial resolution and a high signal-to-noise ratio to detect optically on surfaces ren.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 sowie durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 7 gelöst.This object is achieved by a method having the features of claim 1 and solved by a device with the features of claim 7.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst ein Probenträger mit einer Schicht aus Material mit optisch nichtlinearen Eigenschaften belegt und das Partikel wird auf oder in der nichtlinearen Schicht immobilisiert. In the method according to the invention, a sample carrier with a Layer of material with optically non-linear properties and the particle is immobilized on or in the nonlinear layer.

Als Material für die Schicht können beispielsweise Kristalle mit einer Suszepti bilität zweiter Ordnung verwendet werden. Diese sind in der Lage, bei geeigneter Aus richtung geeignet polarisiertes Licht in der Frequenz zu verdoppeln. Die Polarisation sollte dabei möglichst genau auf die Ausrichtung der Kristallebenen bzw. optischen Hauptachsen der Schicht abgestimmt sein, weshalb auch die optischen Hauptachsen der Schicht selbst möglichst genau auf die Oberfläche des Probenträgers und die Richtung bzw. Polarisation des eingestrahlten Lichts abgestimmt sein müssen.For example, crystals with a suscepti can be used as the material for the layer second order bility can be used. These are able, with a suitable off suitable to double polarized light in frequency. The polarization should be as close as possible to the alignment of the crystal planes or optical Main axes of the layer must be coordinated, which is why the optical main axes the layer itself as precisely as possible on the surface of the sample carrier and the The direction or polarization of the incident light must be coordinated.

Die Polarisation richtet sich nach den Suszeptibilitätskoeffizienten der Schicht. Wenn die Schicht z. B. parallel zur x,y-Ebene liegt und gleich große χ_xxx und χ_yyy- Suszeptibilitätskoeffizienten hat, so wird man die Polarisation des Anregungslichts parallel zur Schicht wählen, kann aber zirkular polarisiert anregen, um z. B. Orientie rungseffekte der Moleküle in der Ebene auszumitteln.The polarization depends on the susceptibility coefficient of the layer. If the layer z. B. is parallel to the x, y plane and has the same size χ _xxx and χ _yyy - susceptibility _coefficients , so you will choose the polarization of the excitation light parallel to the layer, but can excite circularly polarized to z. B. Average orientation effects of the molecules in the plane.

Ebenso können Schichten aus Farbstoffmolekülen mit einer Suszeptibilität drit ter Ordnung verwendet werden. Diese sind in der Lage, bei geeigneter Ausrichtung geeignet polarisiertes Licht in der Frequenz zu verdreifachen. Solche Schichten sind jedoch häufig auch in isotroper, d. h. ungerichteter Anordnung, in der Lage, Licht ohne genau ausgerichtete Polarisation in der Frequenz zu verdreifachen. Nichtlineare Ef fekte noch höherer Ordnung sind prinzipiell auch denkbar.Likewise, layers of dye molecules with a third susceptibility ter order can be used. These are able, with appropriate alignment suitable to triple polarized light in frequency. Such layers are however often also in isotropic, i.e. H. undirected arrangement, able to light without to triple precisely aligned polarization in frequency. Nonlinear Ef In principle, even higher order effects are also conceivable.

Ein Lichtstrahl aus geeigneter Richtung mit geeigneter Polarisation wird sodann auf das Partikel fokussiert. Das fokussierte Licht wird direkt in der nichtlinearen Schicht unmittelbar am Partikel frequenzvervielfacht. Die Wellenlänge bzw. Frequenz des Lichtstrahls wird derart gewählt wird, daß das Partikel bei der vervielfachten Fre quenz optisch nachgewiesen werden kann.A light beam from a suitable direction with a suitable polarization is then focused on the particle. The focused light is directly in the nonlinear Layer multiplied frequency directly at the particle. The wavelength or frequency the light beam is chosen such that the particle at the multiplied Fre quenz can be optically detected.

Die geeignete Richtung des Anregungslichts ergibt sich aus der Art der Be schichtung des Probenträgers. Bei ausschließlich einer nichtlinearen Schicht erfolgt die Anregung vorzugsweise durch den Probenträger hindurch. Wird noch eine zusätz liche Reflexionsschicht zwischen Probenträger und nichtlinearer Schicht eingebracht, so erfolgt die Anregung von der Seite der nichtlinearen Schicht.The suitable direction of the excitation light results from the type of loading layering of the sample carrier. If there is only one non-linear layer the excitation preferably through the sample carrier. Will be an additional introduced reflection layer between sample support and nonlinear layer, so the excitation comes from the side of the nonlinear layer.

Eine geeignete Wellenlänge für die Anregung ist beispielsweise die doppelte oder dreifache Absorptionswellenlänge des Partikels.A suitable wavelength for the excitation is twice, for example or three times the absorption wavelength of the particle.

Zum optischen Nachweis der Partikel eignet sich je nach Art der Partikel eine resonante optische Anregung elektronischer Übergänge, etwa Fluoreszenz oder reso nante Ramanstreuung, oder auch eine nichtresonante optische Anregung, etwa nicht resonante Ramanstreuung.Depending on the type of particle, a is suitable for the optical detection of the particles resonant optical excitation of electronic transitions, such as fluorescence or reso Raman scattering, or a non-resonant optical excitation, for example not resonant Raman scattering.

Durch die Anregung der Partikel mit der frequenzvervielfachten Strahlung er gibt sich ein sehr großer Abstand in den Wellenlängen zwischen Anregungslicht und erzeugtem optischen Signal. Dies ermöglicht eine extrem gute Trennung dieser beiden Signale und führt zu einer nahezu untergrundfreien Detektion der einzelnen Partikel. Das Signal-zu-Rauschen-Verhältnis nimmt extrem hohe Werte an. Beispielsweise liegt das Signal pro detektiertem Partikel im Falle von einzelnen Fluoreszenzfarbstof fen im Bereich von 150 detektierten Photonencounts. Das störende Hintergrundsignal beträgt in den zugehörigen Zeitintervallen zwischen Null und einem Count. Das Si gnal-zu-Rauschen-Verhältnis kann auf diese Weise leicht Werte jenseits von 100 an nehmen.By exciting the particles with the frequency-multiplied radiation he there is a very large distance in the wavelengths between excitation light and generated optical signal. This enables an extremely good separation of these two Signals and leads to an almost underground-free detection of the individual particles. The signal-to-noise ratio takes extremely high values. For example is the signal per detected particle in the case of individual fluorescent dye fen in the range of 150 detected photon counts. The disturbing background signal is between zero and a count in the associated time intervals. The Si Signal-to-noise ratio can easily exceed 100 to take.

Die Frequenzvervielfachung in der Schicht bewirkt eine weitere Lokalisierung der Anregung über die Lokalisierung durch eine evtl. beugungsbegrenzte Fokussie rung hinaus. Dadurch ergibt sich eine erhöhte räumliche Auflösung bei der Detektion der Partikel. Hinzu kommt, daß die stärkere Lokalisierung der Anregung eine weiter verbesserte Diskriminierung zwischen Signal und Rauschen, etwa Streulicht, erlaubt.The frequency multiplication in the layer causes a further localization the suggestion about the localization by a diffraction-limited focus tion. This results in an increased spatial resolution in the detection the particle. In addition, the stronger localization of the excitation is a further one improved discrimination between signal and noise, such as stray light, allowed.

Der Aufbau der Vorrichtung ist apparativ sehr einfach. Gegenüber herkömmli chen Vorrichtungen für die Detektion von einzelnen Partikeln muß lediglich eine Be schichtung des Probenträgers vorgenommen werden.The construction of the device is very simple in terms of apparatus. Compared to conventional Chen devices for the detection of individual particles only a loading layering of the sample carrier.

Das Verfahren und die Vorrichtung sind auf jede Art von Partikeln anwendbar, welche bei optischer Anregung ein optische Signal generieren, seien es vielatomige Teilchen, Makromoleküle, Komplexe oder einzelne Moleküle.The method and the device can be applied to any type of particle, which generate an optical signal with optical excitation, be it multi-atomic Particles, macromolecules, complexes or individual molecules.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen ge kennzeichnet.Advantageous developments of the invention are set out in the subclaims indicates.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher er läutert, die in den Figuren schematisch dargestellt sind. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeichnen dabei gleiche Elemente. Im einzelnen zeigt:The invention is explained in more detail below using exemplary embodiments refines, which are shown schematically in the figures. Same reference numbers in the individual figures denote the same elements. In detail shows:

Fig. 1 eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Detektions vorrichtung; Fig. 1 is a schematic representation of the detection device according to the invention;

Fig. 2 eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Detektions vorrichtung mit einer Reflektorschicht; Figure 2 is a schematic representation of the detection device according to the invention with a reflector layer.

Fig. 3 eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Detektions vorrichtung mit metallischer Spitze; Fig. 3 is a schematic representation of the detection device according to the invention with a metallic tip;

Fig. 4 Grundstrukturen von Farbstoffen mit hohen nichtlinearen Suszeptibilitä ten; und Fig. 4 basic structures of dyes with high nonlinear susceptibility; and

Fig. 5 eine Möglichkeit der Einstrahlung von Licht auf das Partikel. Fig. 5 shows a possibility of irradiation of light on the particle.

1st embodiment

Im Folgenden wird auf Fig. 1 Bezug genommen. In der einfachsten Ausführung der Vorrichtung werden die zu detektierenden Moleküle auf einer dünnen Schicht 4 eines optisch nichtlinearen Materials immobilisiert. Die Schicht selbst ist auf dem op tisch transparenten Substrat 5 (z. B. Mikroskopie-Deckgläschen) aufgebracht. Die Schichtdicke der Schicht 4 ist von der Größenordnung oder kleiner als die Wellenlän ge des anregenden Lichts. Das Material der Schicht 4 muß große Koeffizienten für Frequenzverdopplung bei der Frequenz des Anregungslichts besitzen.In the following, reference is made to FIG. 1. In the simplest embodiment of the device, the molecules to be detected are immobilized on a thin layer 4 of an optically nonlinear material. The layer itself is applied to the optically transparent substrate 5 (e.g. microscopy cover glasses). The layer thickness of the layer 4 is of the order of magnitude or less than the wavelength of the exciting light. The layer 4 material must have large coefficients for frequency doubling at the frequency of the excitation light.

Für eine senkrechte Einstrahlung muß die Schicht 4 nichtlineare Suszeptibilitä ten der Art χ_ijk mit j,k ∈{x,y} und i ∈{x,y,z} besitzen, wobei sich x, y und z auf ein kartesisches Koordinatensystem mit der z-Achse senkrecht zur Oberfläche des Probenträgers 5 beziehen. Senkrecht zur Oberfläche eingestrahltes Licht hat i.d.R. ei ne Polarisation parallel zur Oberfläche, d. h. in der x,y-Ebene. Die erwähnten nichtli nearen Suszeptibilitäten der Art χ_ijk mit j,k ∈{x,y} erzeugen dann effizient fre quenzverdoppelte Strahlung mit einer Polarisationsrichtung parallel zu i. Ist nur einer der Koeffizienten χ_ijk groß, so muß Licht mit der zugehörigen Polarisation einge strahlt werden.For vertical radiation, the layer 4 must have nonlinear susceptibilities of the type χ _ijk with j, k ∈ {x, y} and i ∈ {x, y, z}, where x, y and z refer to a Cartesian coordinate system with the Relate the z axis perpendicular to the surface of the sample carrier 5 . Light radiated perpendicular to the surface usually has a polarization parallel to the surface, ie in the x, y plane. The non-linear susceptibilities mentioned of the type χ _ijk with j, k ∈ {x, y} then efficiently generate frequency-doubled radiation with a polarization direction parallel to i. If only one of the coefficients χ _{ijk is} large, light with the associated polarization must be radiated.

Auch Beschichtungen, bei denen faktisch nur Koeffizienten der Art χ_izz mit i ∈{x,y,z} auftreten, können prinzipiell verwendet werden. Dann muß das Laserlicht unter einem nicht senkrechten Winkel eingestrahlt werden. Eine Möglichkeit dazu zeigt Fig. 5, bei welcher die Einstrahlung des Lichts in Totalreflektion erfolgt. Oder man verwendet, bei senkrechtem Einfall, Laserlicht mit sogenannten Hermite-Gauss- Moden höherer Ordnung, bei welchen es im Laserfokus auch eine Feldkomponente mit starker Polarisation längs der Laserstrahlachse gibt [L. Novotny, E. J. Sanchez, X. S. Xie, "Near-field optical imaging using metal tips illuminated by higher-order Hermite-Gaussian beams", Ultramicroscopy 71(1-4), 21-9, 1998]. Coatings in which in fact only coefficients of the type χ _izz with i ∈ {x, y, z} occur can in principle be used. Then the laser light must be irradiated at a non-perpendicular angle. One possibility for this is shown in FIG. 5, wherein the irradiation is carried out in the light of total reflection. Or one uses, with perpendicular incidence, laser light with so-called Hermite-Gauss modes of higher order, in which there is also a field component with strong polarization along the laser beam axis in the laser focus [L. Novotny, EJ Sanchez, XS Xie, "Near-field optical imaging using metal tips illuminated by higher-order Hermite-Gaussian beams", Ultramicroscopy 71 (1-4), 21-9, 1998].

Anstelle eines nichtlinearen Effektes zweiter Ordnung für Frequenzverdopplung kann auch ein nichtlinearer Effekt dritter Ordnung für eine Frequenzverdreifachung genutzt werden. Effekte dritter Ordnung kommen auch in isotropen Materialien vor. Das hätte den Vorteil, daß eine genaue Ausrichtung der Moleküle der Schicht 4 nicht mehr nötig ist. Auch eine genaue Ausrichtung der Polarisationsebene des Lichtstrahls 1 ist dann nicht nötig. Für die Beschichtung können konventionelle und einfache Techniken, wie z. B. spin coating, verwenden werden. Eine Vielzahl von als Material der Schicht 4 geeigneten Farbstoffen mit hohen Suszeptibilitäten dritter Ordnung fin det sich in dem Buch "Materials for Nonlinear Optics. Chemical Perspectives" von S. R. Marder, J. E. Sohn und G. D. Stucky, erschienen bei ACS, Washington, 1991.Instead of a second order nonlinear effect for frequency doubling, a third order nonlinear effect can also be used for frequency tripling. Third order effects also occur in isotropic materials. This would have the advantage that precise alignment of the layer 4 molecules is no longer necessary. An exact alignment of the polarization plane of the light beam 1 is then also not necessary. Conventional and simple techniques such as e.g. B. spin coating will be used. A variety of dyes suitable as layer 4 material with high third order susceptibilities are found in the book "Materials for Nonlinear Optics. Chemical Perspectives" by SR Marder, JE Sohn and GD Stucky, published by ACS, Washington, 1991.

Als Schichtmaterial kommen z. B. Lithiumniobat, Kaliumniobat, Kaliumtitanyl phosphat oder organische Moleküle mit hohem Suszeptibilitätskoeffizienten in Frage. Als organische Moleküle eignen sich besonders eine Vielzahl von Farbstoffen unter schiedlicher Farbstoffklassen, z. B. Nitroaniline, Azobenzene oder Hemicyanine. Zwei geeignete kommerziell erhältliche Farbstoffe wären Disperse Red 1 und Stilbazolium. Die geeigneten Farbstoffe haben alle die in Fig. 4 gezeigten Grundstrukturen, wobei A einen Elektronenakzeptor und D einen Elektronendonor darstellen, welche über die gezeigte konjugierte Struktur miteinander verbunden sind. Die Zahl der in der Litera tur für Frequenzvervielfachung getesteten Stoffe ist enorm, und alle haben etwa die gleiche oben gezeigte Grundstruktur [s. z. B.: I. Ledoux, J. Zyss, "Polar and non-polar organic molecules, crystals and LB films for quadratic nonlinear optics", in: "Organic Molecules for Nonlinear Optics and Photonics", Eds.: J. Messier, F. Kajzar, P. Prasad, NATO ASI 194, Kluwer Academic, Dordrecht 1991].As layer material such. B. lithium niobate, potassium niobate, potassium titanyl phosphate or organic molecules with a high susceptibility coefficient in question. A large number of dyes with different classes of dyes are particularly suitable as organic molecules. B. nitroanilines, azobenzenes or hemicyanines. Two suitable commercially available dyes would be Disperse Red 1 and Stilbazolium. The suitable dyes all have the basic structures shown in FIG. 4, where A represents an electron acceptor and D represents an electron donor, which are connected to one another via the conjugate structure shown. The number of substances tested in the literature for frequency multiplication is enormous, and all have roughly the same basic structure shown above [eg: I. Ledoux, J. Zyss, "Polar and non-polar organic molecules, crystals and LB films for quadratic nonlinear optics ", in:" Organic Molecules for Nonlinear Optics and Photonics ", Eds .: J. Messier, F. Kajzar, P. Prasad, NATO ASI 194, Kluwer Academic, Dordrecht 1991].

Die Schicht 4 wird auf das Substrat 5 in bekannter Weise, z. B. durch Epitaxie oder im Falle organischer Moleküle durch eine Langmuir-Blodgett-Technik, aufge bracht.Layer 4 is applied to substrate 5 in a known manner, e.g. B. by epitaxy or in the case of organic molecules by a Langmuir-Blodgett technique, brought up.

Kristalline Schichten, speziell Kaliumniobat, können epitatktisch durch ver schiedene Verfahren aufgebracht werden:
Crystalline layers, especially potassium niobate, can be applied epitatctically by various methods:

- Pulsed laser deposition [p. Y. Jong, L. Hesselink, "Synthesis and properties of ferroelectric niobate thin films prepared by pulsed la this deposition for optical waveguide application ", Journal of the Korean Physical Society 32, suppl. Issue, pp. 1369-71, 1998],
- epitaxial sol-gel growth (sol-gel epitaxial growth) [X. Yuhuan, H.C. Chih, L. Yudan, J.D. Mackenzie, "Epitaxial ferroelectric thin films prepared by the sol gel technique ", Ferroelectrics 195 (1-4), 283-8, 1997],
- Metallorganic chemical vapor deposition (metalorganic chemical va por deposition (MOCVD)) [A. Onoe, A. Yoshida, K. Chikuma, "Heteroepitaxial growth of KNbO / sub 3 / single-crystal films on SrTiO / sub 3 / by metalorganic che mical vapor deposition ", Applied Physics Letters 69 (2), 167-9, 1996],
- Ion beam sputtering [M. S. Ameen, T. M. Graettinger, S. H. Rou, H.N. Al Shareef, K.D. Gifford, O. Auciello, A.I. Kingon, "Processing and structural characterization of ferroelectric thin films deposited by ion beam sputte ring, "Ferroelectric Thin Films Symposium, Mater. Res. Soc, Pittsburgh, PA, USA; 66-76, 1990].

Als Schicht 4 kann auch eine Polymerschicht verwendet werden, in die Nano partikel eingebettet sind [s. R. La Peruta, E. A. Van Wagenen, J. J. Roche, P. Kiti pichai, G. E. Wuek, G. M. Korenowski, "Preparation and Characterization of Silver Colloid/Polymer Composite Nonlinear Optical Materials", Proc. SPIE vol. 1497 (1991) S. 357-66]. Das Polymermaterial dort ist Polyacetylen, mit eingelagerten 10 nm großen Silberteilchen. Eine solche Schicht 4 zeigt nur optisch nichtlineare Effekte dritter Ordnung. Die Schicht 4 kann in gelöstem Zustand durch einfache Beschichtung mit anschließender Lösungsmittelverdunstung und Thermopolymerisation aufgebracht werden.A polymer layer can also be used as layer 4 , in which nano-particles are embedded [see FIG. R. La Peruta, EA Van Wagenen, JJ Roche, P. Kiti pichai, GE Wuek, GM Korenowski, "Preparation and Characterization of Silver Colloid / Polymer Composite Nonlinear Optical Materials", Proc. SPIE vol. 1497 (1991) pp. 357-66]. The polymer material there is polyacetylene, with embedded 10 nm silver particles. Such a layer 4 shows only optically non-linear effects of the third order. The layer 4 can be applied in the dissolved state by simple coating with subsequent solvent evaporation and thermopolymerization.

Die optische Anregung erfolgt durch einen Laserstrahl 1, welcher durch ein (nicht gezeigtes) herkömmliches Mikroskopobjektiv mit hoher numerischer Apertur beugungsbegrenzt durch das Substrat 5 in die Schicht 4 fokussiert wird. Der Laser strahl 1 wird bevorzugt von einem gepulsten Laser generiert, da bei einem gepulsten Laser die Konversionseffizienz bei der Frequenzvervielfachung wesentlich höher ist als bei einem kontinuierlichen Laser. Es kann zum Beispiel ein Titan-Saphir-Laser mit Femtosekundenpulskompression, welcher durch einen Argonionen-Laser gepumpt wird, zur Anwendung kommen. Die Anregungswellenlänge liegt dann im Bereich von 750 nm bis etwa 900 nm, die Pulslänge im Bereich von kleiner 50 fs bei einer typi schen Pulswiederholrate von 78 MHz und einer mittleren Laserleistung bis 1 W.The optical excitation takes place by means of a laser beam 1 , which is focused by means of a conventional microscope objective (not shown) with a high numerical aperture and diffraction-limited through the substrate 5 into the layer 4 . The laser beam 1 is preferably generated by a pulsed laser, since in a pulsed laser the conversion efficiency in frequency multiplication is significantly higher than in a continuous laser. For example, a titanium sapphire laser with femtosecond pulse compression, which is pumped through an argon ion laser, can be used. The excitation wavelength is then in the range from 750 nm to approximately 900 nm, the pulse length in the range of less than 50 fs at a typical pulse repetition rate of 78 MHz and an average laser power of up to 1 W.

Der fokussierte Laserstrahl 1 erzeugt in der Schicht 4 ein lokal begrenztes Ge biet 3 mit einem elektromagnetischen Feld, welches auf der vervielfachten Frequenz des anregenden Lichts schwingt. Die optische Anregung des auf der Oberfläche be findlichen Moleküls 2 erfolgt hauptsächlich durch Energietransfer im Nahfeld des Ge biets 3, so daß die Schichtdicke der Schicht 4 kleiner als die Wellenlänge des anre genden Lichtes sein kann.The focused laser beam 1 generates in the layer 4 a locally limited Ge area 3 with an electromagnetic field which vibrates at the multiplied frequency of the exciting light. The optical excitation of the molecule on the surface be sensitive 2 takes place mainly by energy transfer in the near field of Ge area 3 , so that the layer thickness of the layer 4 can be less than the wavelength of the exciting light.

Ein großer Vorteil dieser Anregungsmethode besteht darin, daß durch die ex treme räumliche Begrenzung des Gebietes 3 kaum freie Photonen auf der doppelten oder vielfachen Frequenz des Anregungslichts erzeugt werden und jede Ramanstreu ung dieser Photonen gänzlich vernachlässigbar ist, was das Signal-zu-Rauschen- Verhältnis weiter verbessert. Durch den Energietransfercharakter der Anregung wer den außerdem nur Moleküle effizient angeregt, welche sich in einer Entfernung von wenigen bis etwa 100 Nanometern zur Oberfläche befinden (innerhalb des sogenann ten Försterradius). Da die Effizienz z. B. der Frequenzverdopplung proportional zum Quadrat der Anregungsintensität ist, ist die seitliche Ausdehnung des Gebietes 3 au ßerdem um etwa den Faktor 1/√2 kleiner als die Ausdehnung des anregenden Laser strahls 1.A great advantage of this excitation method is that due to the extreme spatial limitation of the area 3, hardly any free photons are generated at double or multiple frequencies of the excitation light and any Raman scattering of these photons is completely negligible, which is the signal-to-noise ratio further improved. Due to the energy transfer character of the excitation, only those molecules are efficiently excited which are located within a few to about 100 nanometers from the surface (within the so-called Förster radius). Since the efficiency z. B. the frequency doubling is proportional to the square of the excitation intensity, the lateral extent of the area 3 is also approximately 1 / √2 smaller than the extent of the exciting laser beam 1 .

Die Detektion des erzeugten optischen Signals erfolgt entweder in Richtung 6 (Auflichtanordnung) durch das gleiche Objektiv, welches den anregenden Laserstrahl 1 fokussiert, oder in Richtung 7 durch ein zweites Mikroskopobjektiv. Das optische Signal wird durch einen (nicht gezeigten) herkömmlichen dichroitischen Spiegel vom Anregungslicht getrennt und über (nicht gezeigte) herkömmliche optische Filter, wel che Anregungslicht und frequenzvervielfachtes Licht gegen das erzeugte optische Si gnal diskriminieren, auf einen (nicht gezeigten) Einzelphotonen-empfindlichen De tektor gelenkt, der die detektierten Photonen in elektronisch weiter verwertbare Si gnale umwandelt. Als Detektor kommen herkömmliche Photoelektronenvervielfacher oder Einzelphotonen-Avalanchephotodioden zur Anwendung.The optical signal generated is detected either in direction 6 (incident light arrangement) by the same objective which focuses the exciting laser beam 1 , or in direction 7 by a second microscope objective. The optical signal is separated from the excitation light by a conventional dichroic mirror (not shown) and via a conventional optical filter (not shown) which discriminates excitation light and frequency-multiplied light against the optical signal generated, to a single-photon-sensitive De (not shown) tector directed, which converts the detected photons into electronically usable signals. Conventional photoelectron multipliers or single-photon avalanche photodiodes are used as detectors.

Um alle auf der Schicht 4 imniobilisierten Partikel 2 zu detektieren, wird die Oberfläche abgescannt.In order to detect all particles 2 immobilized on layer 4 , the surface is scanned.

2nd embodiment

Im Folgenden wird auf Fig. 2 Bezug genommen. Der Aufbau ist analog zu dem jenigen gemäß Fig. 1, jedoch ist zwischen nichtlinearer Schicht 4 und Substrat 5 eine dielektrische optische Filterschicht 8 (analog zur optischen Schicht eines dichroiti schen Filters) eingebracht, welche einen hohen Reflexionskoeffizienten für die Anre gungswellenlänge hat, das in den unteren Halbraum abgestrahlte optische Signal aber weitestgehend durchläßt. Die optische Anregung erfolgt ebenfalls durch einen beu gungsbegrenzt fokussierten Laserstrahl 1, aber diesmal von oben. Die Detektion des erzeugten optischen Signals erfolgt entweder in Rückwärtsrichtung durch dasselbe Mikroskopobjektiv, durch das auch der Laserstrahl 1 fokussiert wurde, oder in Rich tung 6 durch ein zweites Mikroskopobjektiv.In the following, reference is made to FIG. 2. The structure is analogous to that according to FIG. 1, however, a dielectric optical filter layer 8 (analogous to the optical layer of a dichroic filter's) is introduced between nonlinear layer 4 and substrate 5 , which has a high reflection coefficient for the excitation wavelength, which in the optical signal emitted in the lower half-space as far as possible. The optical excitation also takes place by a diffraction-limited focused laser beam 1 , but this time from above. The detection of the generated optical signal takes place either in the reverse direction by the same microscope objective through which the laser beam 1 was focused, or in direction 6 by a second microscope objective.

Der Vorteil dieses Aufbaus besteht darin, daß durch die reflektive Schicht 8 über dem Substrat eine stehende Lichtwelle aufgebaut wird, deren lokale Feldintensität eine Viertel-Wellenlänge (des Anregungslichts) über der reflektiven Schicht 8 doppelt so hoch ist wie diejenige gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel. Entsprechend sollte die nichtlineare Schicht 4 eine Dicke von etwa einem Viertel der Wellenlänge des Anre gungslichts besitzen, so daß an der Oberseite der Schicht 4 eine maximale Frequenz vervielfachung erfolgt. Zusätzlich wirkt die reflektive Schicht 8 auch als erster opti scher Filter für das Anregungslicht und einen Teil des frequenzvervielfachten Lichts.The advantage of this structure is that a standing light wave is built up by the reflective layer 8 above the substrate, the local field intensity of which is a quarter wavelength (of the excitation light) above the reflective layer 8 twice as high as that according to the first exemplary embodiment. Accordingly, the non-linear layer 4 should have a thickness of about a quarter of the wavelength of the excitation light, so that a maximum frequency multiplication takes place at the top of the layer 4 . In addition, the reflective layer 8 also acts as a first optical filter for the excitation light and part of the frequency-multiplied light.

3rd embodiment

Im Folgenden wird auf Fig. 3 Bezug genommen. Bei diesem Ausführungsbei spiel erfolgt die optische Anregung nicht direkt durch einen senkrecht fokussierten Laserstrahl, sondern durch das lokalisierte elektromagnetische Feld am Spitzenapex einer metallischen Spitze 9. Bei dieser Spitze soll es sich um die Spitze eines her kömmlichen Atomkraftmikroskops handeln. Die Spitze bzw. Sonde 9 hat einen feld verstärkenden Effekt für das eingestrahlte Anregungslicht 11. Der Krümmungsradius der Spitze am Spitzenapex ist wesentlich kleiner als die Wellenlänge des Anregungs lichts 11. Vorzugsweise beträgt der Krümmungsradius wenige Nanometer.In the following, reference is made to FIG. 3. In this embodiment, the optical excitation does not take place directly through a vertically focused laser beam, but rather through the localized electromagnetic field at the tip apex of a metallic tip 9 . This tip is said to be the tip of a conventional atomic force microscope. The tip or probe 9 has a field-enhancing effect for the incident excitation light 11 . The radius of curvature of the tip at the apex apex is significantly smaller than the wavelength of the excitation light 11th The radius of curvature is preferably a few nanometers.

Das Anregungslicht 11 wird seitlich auf die Spitze 9 fokussiert, wie es z. B. in herkömmlichen optischen Nahfeldmikroskopen geschieht, um dort eine Seiten schwingung der Lichtleitfaser zu detektieren. Das Anregungslicht 11 weist eine haupt sächlich parallel zur Spitze 9 orientierte Polarisation auf, da nur für eine derartige Lichtwelle eine effektive lokale Feldverstärkung erfolgt. Die Anregung kann jedoch auch über einen senkrecht eingestrahlten Laserstrahl mit Hermite-Gauss-Moden erfol gen [siehe die bereits zitierte Arbeit: L. Novotny, E. J. Sanchez, X. S. Xie, "Near-field optical imaging using metal tips illuminated by higher-order Hermite-Gaussian be ams", Ultramicroscopy 71(1-4), 21-9, 1998]. The excitation light 11 is laterally focused on the tip 9 , as z. B. in conventional optical near-field microscopes to detect a side vibration of the optical fiber there. The excitation light 11 has a polarization oriented mainly parallel to the tip 9 , since an effective local field amplification takes place only for such a light wave. However, the excitation can also take place via a vertically irradiated laser beam with Hermite-Gauss modes [see the work already cited: L. Novotny, EJ Sanchez, XS Xie, "Near-field optical imaging using metal tips illuminated by higher-order Hermite -Gaussian be ams ", Ultramicroscopy 71 (1-4), 21-9, 1998].

Das am Spitzenapex verstärkte und lokalisierte elektromagnetische Feld wird nun dazu verwendet, in der Schicht 4 des nichtlinearen optischen Materials das stark lokalisierte Gebiet 3 mit frequenzverdoppeltem elektromagnetischem Feld zu erzeu gen.The amplified and localized electromagnetic field at the apex is now used to generate the highly localized area 3 with frequency-doubled electromagnetic field in the layer 4 of the nonlinear optical material.

Die Spitze 9 kann dabei gleichzeitig als Sonde eines Atomkraftmikroskops wir ken, so daß über simultan erfolgende Atomkraftmessungen der Abstand der Spitze 9 zur Schicht 4 sehr klein, z. B. innerhalb weniger Nanometer, gehalten werden kann.The tip 9 can simultaneously act as a probe of an atomic force microscope, so that the distance between the tip 9 and the layer 4 is very small, for example, via simultaneous atomic force measurements. B. can be kept within a few nanometers.

Das optisch nichtlineare Material der Schicht 4 muß einen hinreichend großen Frequenzverdopplungskoeffizienten besitzen für die Erzeugung eines frequenzver doppelten elektromagnetischen Feldes mit einer Polarisation 12 parallel zur nichtli nearen Schicht 4 bei Anregung mit einem elektromagnetischen Feld mit einer Polari sation 10 vertikal zur nichtlinearen Schicht 4. Es kann sich bei dem Material der Schicht 4 z. B. um Kaliumniobat handeln, welches eine hohe dielektrische Suszeptibi lität zweiter Ordnung mit dieser Eigenschaft aufweist. Dazu muß das Kristallachsen system des Kaliumniobat-Kristalls geeignet zur Oberfläche des Probenträgers 5 ausge richtet sein.The optically non-linear material of the layer 4 must have a sufficiently large frequency doubling coefficient for the generation of a frequency-doubled electromagnetic field with a polarization 12 parallel to the non-linear layer 4 when excited with an electromagnetic field with a polarization 10 vertical to the non-linear layer 4 . It can be in the material of the layer 4 z. B. Potassium niobate, which has a high dielectric susceptibility second order with this property. For this purpose, the crystal axis system of the potassium niobate crystal must be aligned with the surface of the sample carrier 5 .

Dies kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, daß als Probenträger 5 ein Magnesiumoxid-(MgO)-Kristall verwendet wird, der parallel zur (100)- Kristallebene geschnitten ist. Auf dieser Schnittfläche läßt man als Schicht 4 einen Kaliumniobat- Kristall in bekannter Weise epitaktisch aufwachsen [C. Zaldo, D. S. Gill, R. W. Eason, J. Mendiola, P. J. Chandler, "Growth of KNbO₃ thin films on MgO by pulsed laser de position", Applied Physics Letters 65(4), S. 502-4, 1994; M. J. Martin, J. E. Alfonso, J. Mendiola, C. Zaldo, D. S. Gill, R. W. Eason, P. J. Chandler, "Pulsed laser deposition of KNbO₃ thin films", Journal of Materials Research 12(10), S. 2699-706, 1997]. Der gewachsene Kaliumniobat-Kristall ist dann derart ausgerichtet, daß seine (110)- Kri stallebene parallel zur geschnittenen Oberfläche des MgO-Kristalls also parallel zur Schicht 4 ist. Dann besitzt die Schicht 4, bzgl. eines kartesischen Koordinatensystems mit der z-Achse senkrecht zur Schicht 4 und der x-Achse in der Schicht 4 senkrecht zur (001)-Kristallebene des Kaliumniobats, u. a. einen großen nichtlinearen Koeffizi enten χ_xzz' wie man ihn für das Verfahren benötigt.This can be achieved, for example, by using a magnesium oxide (MgO) crystal as the sample carrier 5 , which crystal is cut parallel to the (100) crystal plane. A layer of potassium niobate crystal is grown epitaxially in a known manner as layer 4 on this cut surface [C. Zaldo, DS Gill, RW Eason, J. Mendiola, PJ Chandler, "Growth of KNbO ₃ thin films on MgO by pulsed laser de position", Applied Physics Letters 65 (4), pp. 502-4, 1994; MJ Martin, JE Alfonso, J. Mendiola, C. Zaldo, DS Gill, RW Eason, PJ Chandler, "Pulsed laser deposition of KNbO ₃ thin films", Journal of Materials Research 12 (10), pp. 2699-706, 1997 ]. The grown potassium niobate crystal is then aligned in such a way that its (110) crystal level is parallel to the cut surface of the MgO crystal, ie parallel to layer 4 . Then layer 4 , with respect to a Cartesian coordinate system with the z axis perpendicular to layer 4 and the x axis in layer 4 perpendicular to the (001) crystal plane of the potassium niobate, has, among other things, a large non-linear coefficient _{Ko xzz '} as one can needed him for the procedure.

Wird Licht mit einer Polarisation 10 vertikal zur nichtlinearen Schicht 4 und somit parallel zur Spitze 9 eingestrahlt, so weißt dieses Licht starke Feldkomponenten parallel zur z-Achse auf. Aufgrund der hohen nichtlinearen Suszeptibilität χ_xzz hat die frequenzverdoppelte Strahlung eine Polarisation 12 parallel zur x-Achse, d. h. parallel zur nichtlinearen Schicht 4, wie es benötigt wird.If light with a polarization 10 is radiated vertically to the non-linear layer 4 and thus parallel to the tip 9 , then this light has strong field components parallel to the z-axis. Because of the high nonlinear susceptibility χ _xzz , the frequency-doubled radiation has a polarization 12 parallel to the x-axis, ie parallel to the nonlinear layer 4 , as is required.

Durch das erzeugte frequenzverdoppelte Feld mit paralleler Polarisation 12 wer den nun bevorzugt Moleküle mit einer Orientierung ihres Absorptionsdipols parallel zur Richtung 12 angeregt. Dies geschieht hauptsächlich durch Energietransfer im Nah feld des Gebietes 3. Da bei den meisten Molekülen die Orientierung des Emis sionsdipols und des Absorptionsdipols z. B. bei der Fluoreszenz nicht wesentlich ver schieden sind, wird die Fluoreszenzemission der Moleküle nicht durch die metallische Spitze 11 gelöscht. Es erfolgt also kein Energietransfer zwischen angeregtem Partikel 2 und Spitze 11. Dies ist dadurch bedingt, daß das Dipolmoment der Spitze 11 senk recht zum Dipolmoment des Emissionsdipols des angeregten Partikels 2 steht.The generated frequency-doubled field with parallel polarization 12 now excites the molecules with an orientation of their absorption dipole parallel to the direction 12 . This is mainly done through energy transfer in the near field of area 3 . Since with most molecules the orientation of the emission dipole and the absorption dipole z. B. are not significantly different in fluorescence, the fluorescence emission of the molecules is not deleted by the metallic tip 11 . There is therefore no energy transfer between excited particle 2 and tip 11 . This is due to the fact that the dipole moment of the tip 11 is perpendicular to the dipole moment of the emission dipole of the excited particle 2 .

Die Detektion des optischen Signals erfolgt i.d.R. mit einem (nicht gezeigten) Mikroskopobjektiv durch das Substrat 5 hindurch.The detection of the optical signal is usually carried out with a microscope objective (not shown) through the substrate 5 .

Durch Abtasten der Oberfläche der nichtlinearen Schicht 4 können Partikel 2 mit hoher räumlicher Auflösung detektiert werden.By scanning the surface of the nonlinear layer 4 , particles 2 can be detected with high spatial resolution.

Im Rahmen der Erfindung sind zahlreiche Abwandlungen und Weiterbildungen der beschriebenen Ausführungsbeispiele verwirklichbar. Insbesondere ist es auch denkbar, durch Beobachtung der erzeugten frequenzvervielfachten Strahlung Absorp tionsmessungen am einzelnen Molekül durchzuführen. Die Emission der frequenzver vielfachten Strahlung, die ohnehin sehr gering ist, erfährt einen weiteren Einbruch, wenn ein Teil dieser Strahlung von einem Molekül bzw. Partikel absorbiert wird.Numerous modifications and developments are within the scope of the invention of the described embodiments can be realized. In particular, it is conceivable, by observing the frequency-multiplied radiation Absorp tion measurements on the individual molecule. The emission of the frequency ver multiple radiation, which is very low anyway, experiences a further drop, when part of this radiation is absorbed by a molecule or particle.

Das dritte Ausführungsbeispiel läßt sich bei geeigneten Suszeptibilitäten auch mit nichtlinearen optischen Effekten dritter oder höherer Ordnung und frequenzver dreifachter oder allgemein frequenzvervielfachter Strahlung erreichen.The third exemplary embodiment can also be used with suitable susceptibilities with third-order or higher-order nonlinear optical effects and freq achieve triple or generally frequency-multiplied radiation.

Das dritte Ausführungsbeispiel läßt sich außer mit Kaliumniobat mit einer Viel zahl anderer Substanzen realisieren, die z. B. im "Handbook of Nonlinear Optical Cry stals" von V. G. Dmitriev, G. G. Gurzadyan und D. N. Nikogosyan (Springer, Second edition, 1997) aufgeführt sind. Wesentlich ist nur, daß das Material hinreichend große Suszeptibilitäten der Art χ_xzz und/oder χ_yzz hat (in kartesischen Koordinaten, mit der z-Achse senkrecht zur Schicht 4).The third embodiment can be realized with a lot of other substances besides potassium niobate, which, for. B. in the "Handbook of Nonlinear Optical Cry Stals" by VG Dmitriev, GG Gurzadyan and DN Nikogosyan (Springer, Second edition, 1997). It is only important that the material has sufficiently large susceptibilities of the type χ _xzz and / or χ _yzz (in Cartesian coordinates, with the z axis perpendicular to layer 4 ).

Claims

1. Method for the optical detection of a particle ( 2 ),
wherein a sample carrier ( 5 ) is coated with a layer ( 4 ) of material with optically non-linear properties with a suitable orientation;
wherein the particle ( 2 ) is immobilized on or in the nonlinear layer ( 4 );
wherein a light beam ( 1 ) is focused on the particle from a suitable direction with suitable polarization, as a result of which the focused light in the nonlinear layer ( 4 ) is partially frequency multiplied ( 3 ),
the wavelength or frequency of the light beam ( 1 ) being selected such that the particle ( 2 ) can be optically detected at the multiplied frequency;
the particle ( 2 ) being excited by the frequency-multiplied radiation ( 3 ); and
wherein the optical signal ( 7 ) generated due to the excitation is detected.

2. The method according to claim 1, characterized in that the light beam ( 1 ) from the particle ( 2 ) facing away from the sample carrier ( 5 ) is focused on the particle.

3. The method according to claim 1, characterized in
that the sample carrier ( 5 ) is first coated with a layer ( 8 ) of optically reflecting material for light of the named wavelength and above that with the layer ( 4 ) of material with optically non-linear properties; and
that the light beam ( 1 ) with the stated wavelength is focused from the coated side of the sample carrier ( 5 ) onto the particle ( 2 ), as a result of which the focused light reflects on the reflecting layer ( 8 ) and in the non-linear layer ( 4 ) is partially frequency multiplied ( 3 ).

4. The method according to claim 3, characterized in that the non-linear layer ( 4 ) with a thickness of about a quarter of said wavelength is formed out.

5. The method according to claim 1, characterized in
that for the layer ( 4 ) a material is selected that has a suitable non-linear susceptibility coefficient for generating a frequency-multiplied electromagnetic field with a polarization ( 12 ) parallel to the non-linear layer ( 4 ) when excited with the light beam ( 11 ) a component of the electric field of the light beam ( 10 ) vertical to the non-linear layer ( 4 );
that a metallic tip ( 9 ) is brought up to the particle ( 2 );
that the light beam ( 11 ) is focused on the particle ( 2 ) such that a non-zero component of the electric field of the light beam results parallel to the metallic tip ( 9 );
that the light beam ( 11 ) in the non-linear layer ( 4 ) excites an electromagnetic oscillation with a multiple of said frequency ( 3 ); and that the particle ( 2 ) is excited by the electromagnetic vibration ( 3 ).

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that organic molecules are selected as the material for the nonlinear layer ( 4 ), the organic molecules having an electron acceptor and an electron donor, which are connected to one another via an electronically conjugated structure.

7. Device for the optical detection of a particle ( 2 ) with
a sample carrier ( 5 ) which is coated with a layer ( 4 ) of optically nonlinear material with a suitable orientation, the particle ( 2 ) being immobilized on or in the layer ( 4 ) of optically nonlinear material;
a light source for generating a light beam ( 1 ) of suitable wavelength, intensity and polarization;
focusing optics for focusing the light beam ( 1 ) from a suitable direction and with suitable polarization onto the particle ( 2 ), thereby generating an optical signal;
collecting optics ( 6 ) for collecting the generated optical signal; and with
a detection device ( 1 ) for detecting the optical signal generated, the collecting optics ( 6 ) imaging the collected optical signal onto the detection device.

8. The device according to claim 7, characterized in that under the layer ( 4 ) made of optically nonlinear material, a layer ( 8 ) of light of the said wavelength optically reflective material on the sample carrier ( 5 ) is arranged on.

9. The device according to claim 8, characterized in that the non-linear layer ( 4 ) has a thickness of about a quarter of said wavelength.

10. The device according to claim 7, characterized in that
that a metallic tip ( 9 ) is brought up to the particle ( 2 ); and
that the layer ( 4 ) consists of a material which has a suitable non-linear susceptibility coefficient for the generation of a frequency-multiplied electromagnetic field with a polarization ( 12 ) parallel to the layer ( 4 ) when excited by the light beam ( 11 ) with a polarization ( 10 ) be vertical to the layer ( 4 ).

11. Device according to one of claims 7 to 10, characterized in that the material for the non-linear layer ( 4 ) comprises organic molecules, the organic molecules having an electron acceptor and an electron donor, which are connected to one another via an electronically conjugated structure.